Флуоресцентная спектроскопия

Сентябрь 3, 2022

Главная
Алгебра
Флуоресцентная спектроскопия

Содержание

2. Люминесценция – способность многих органичес-ких и неорганических веществ к самостоятельному свечению, которое возникает в результате различ-ных
3. Типы люминесценции ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ свечение под влиянием света (УФ- и видимого) Флуоресценция τ = 10-9 - 10-6
4. Флуоресценция (частный случай люминесценции), широко распространена в природе и может происхо- дить в газах, растворах и
5. Флуорофор – молекула или фрагмент молекулы, придающий ей флуоресцентные свойства. Как правило, флуорофором является карбо- или
6. Флуорофоры
7. Природа флуоресценции (диаграмма Яблонского - энергия электронов в основном и возбужденном состояниях при флуоресценции) ЭНЕРГИЯ ЭЛЕКТРОНОВ
8. Диаграмма Яблонского So S2 S1 fluorescence τ = 10-15 с (τ = 10-8 с)
9. Устройство спектрофлуорметра (вид сверху) Монохроматор 1 Выделяет λ, которая максимально поглощается веществом Монохроматор 2 Выделяет λ,
10. Спектры возбуждения и спектры флуоресценции Спектр возбуждения - зависимость количества поглощенного света от длины волны (то
11. Спектры возбуждения и флуоресценции сдвиг Стокса Из правого графика следует, что флуорофор будет флуоресцировать при любой
12. Спектры возбуждения (поглощения), как и спектры флуоресценции могут существенно меняться при изменении концентрации раствора, его кислотности
13. Основные закономерности флуоресценции Флуоресценция происходит при любой длине волны возбуждающего света. 2. Q (квантовый выход флуоресценции):
14. Зависимость интенсивности флуоресценции (Fф) от концентрации вещества Fф = Io x Q x C Io –
15. Интенсивность флюоресценции (Fф) флуорофора линейно зависит от его концентрации (С) только в области малых концентраций (10-11
16. Классификация флуорофоров: 1. Биологические флуорофоры. Пиридиновые нукле- отиды (кофакторы), ароматические аминокислоты в составе белков (90% флуоресценции
17. Антрацен Флуоресцеин Родамин 6G Структурные формулы некоторых флуорофоров Большинство малых органических флуорофоров, нашедших практическое применение в
18. 3. Особой группой флуоресцентных соединений явля- ются квантовые точки (полупроводниковые нано- кристаллы). При уменьшении физических размеров
19. Квантовые точки одного и того же химического стро- ения, в зависимости от своих размеров, дают флуорес-
20. Материалы, из которых изготавливаются квантовые точки (Cd, Pb и др.) токсичны для клеток. Для умень-шения токсичности
21. Флуоресцентные вещества, применяемые в биоло-гии, можно условно разделить на две большие группы: 1. Флуоресцентные метки -
22. 2. Флуоресцентные зонды. Это молекулярная конструкция, которая может существовать в двух со-стояниях: «выключенном» и «включённом». Эти
23. Применение флуоресцентного зонда ПИРЕН для изучения поступательного движения молекул в биомембране (оценка вязкости липидного бислоя) 300
24. Тушение (гашение) флуоресценции. Тушение флуоресценции происходит вследствие того, что излучаемая флуорофором энергия передается молекулам других веществ,
25. Основные факторы, вызывающие тушение флуоресценции Увеличение температуры - температурное тушение. С повышением температуры частота столкновений возбужденных
26. 3. Присутствие в растворе посторонних примесей, которые могут изменить рН раствора, что также приводит к тушению
27. Тушение флуоресценции описывается уравнением Штерна-Фольмера, имеющего свое графическое представление - график Штерна-Фольмера Fo и F -
28. Для того, чтобы в полной мере реализовать высо- кую чувствительность, свойственную флуориметрии, необходимо: возбуждать флуоресценцию при
30. Скачать презентацию

Слайд 2

Люминесценция – способность многих органичес-ких и неорганических веществ к самостоятельному

свечению, которое возникает в результате различ-ных внешних воздействий.
Люминесценция (англ. luminescence) –
- свечение.
Термин введен Видеманом в 1889 году.

Слайд 3

Типы люминесценции
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение под влиянием
света (УФ- и видимого)
Флуоресценция
τ =

10-9 - 10-6 с

Фосфоресценция
τ = 10-3 - 10-1 с

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение, использует
энергию хим. реакций

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
способность живых организмов
светиться, достигаемая само-
стоятельно или с помощью
симбионтов.

Слайд 4

Флуоресценция (частный случай люминесценции),
широко распространена в природе и может

происхо-
дить в газах, растворах и твёрдых телах.
Флуоресценция – испускание света молекулой-флуорофором (вторичный световой поток), возбуж-дённой световым излучением (первичный световой поток). Вторичный световой поток возникает при переходе молекул флуорофора из возбужденного электронного состояния (S1) в основное (So).
Флуоресценция прекращается сразу при исчезно-вении возбуждающего светового потока. (Затухание флуоресценции в этих условиях происходит в тече-нии наносекунд).

Слайд 5

Флуорофор – молекула или фрагмент молекулы, придающий ей флуоресцентные свойства.
Как правило,

флуорофором является карбо- или гетероциклическая структура, которая поглощает квант светового потока с определённой энергией (определенной длины волны).
Количество энергии (длина волны) излучаемого света зависят от химической природы флуорофора и от параметров его окружения (вязкость, поляр-ность и др.).

Слайд 6

Флуорофоры

Слайд 7

Природа флуоресценции (диаграмма Яблонского - энергия электронов в основном и возбужденном состояниях

при флуоресценции)

ЭНЕРГИЯ ЭЛЕКТРОНОВ

Основное состояние, So

S1, первое
возбужд.
состояние

S2, второе
возбужд.
состояние

+ hν

Потеря части энергии
за счет взаимостолкновений
молекул и атомов (вибрационная
релаксация), τ = 10-15 с

Излучаемые hν,
вторичное излучение
(вторичный световой поток)

Энергия излучаемых hν всегда
меньше энергии
возбуждающих hν − сдвиг Стокса

Испускание оставшейся
энергии в виде вторичного
светового излучения.
Длительность флуресценции
одной возбужденной молекулы
флуорофора, τ = 10-8 с

Слайд 8

Диаграмма Яблонского
So
S2
S1
fluorescence
τ = 10-15 с
(τ = 10-8 с)

Слайд 9

Устройство спектрофлуорметра (вид сверху)
Монохроматор 1
Выделяет λ, которая
максимально поглощается
веществом
Монохроматор 2
Выделяет λ, при
которой Fф
максимальна
λ

возб.

λ флуор.

ФЭУ

Две лампы
для обеспечения полно-
диапазонного светового
потока в УФ и видимой
областях спектра

Кювета с
образцом

Вторичное
излучение –
- флуоресценция

Измерение Fф

Слайд 10

Спектры возбуждения и спектры флуоресценции
Спектр возбуждения - зависимость количества
поглощенного

света от длины волны (то же, что
спектр поглощения).
Спектр флуоресценции – интенсивность флуо-ресценции (Iф), измер. при различных длинах волн.

Е, Iф

Возб.

Флуор.

сдвиг Стокса

Сдвиг Стокса – энергия кванта флуоресценции всегда меньше энергии кванта возбуждения –
- mах. флуоресценции сдвинут в
длинноволновую область

Слайд 11

Спектры возбуждения и флуоресценции
сдвиг Стокса
Из правого графика следует, что флуорофор будет

флуоресцировать при любой длине волны возбуждаю-
щего света. Но, чем дальше будем отклоняться от λ макс.
возбуждения, тем меньше будет интенсивность
флуоресценции.

Слайд 12

Спектры возбуждения (поглощения), как и спектры флуоресценции могут существенно меняться

при изменении концентрации раствора, его кислотности или щелочности (рН), природы растворителя, температуры и ряда других факторов.

Слайд 13

Основные закономерности флуоресценции
Флуоресценция происходит при любой длине
волны возбуждающего света.
2. Q

(квантовый выход флуоресценции):
число квантов флуресценции
Q =
число поглощенных квантов
3. Закон Вавилова: Q не зависит от длины волны
возбуждающего света.

Слайд 14

Зависимость интенсивности флуоресценции (Fф) от концентрации вещества
Fф = Io x Q

x C

Io – интенсивность возбуждающего света;
Q – квантовый выход;
С – концентрация вещества

Флуоресцентный анализ на порядок чувствитель-
ней, чем спектрофотометрия.

Слайд 15

Интенсивность флюоресценции (Fф) флуорофора линейно зависит от его концентрации (С)

только в области малых концентраций (10-11 - 10-4 моль/л).
При увеличении концентрации раствора флуорофора линейность нарушается вследствие тушения флюоресценции (уменьшения ее интен-сивности). В таких условиях анализ сопряжен с большой погрешностью.

Слайд 16

Классификация флуорофоров:
1. Биологические флуорофоры. Пиридиновые нукле-
отиды (кофакторы), ароматические аминокислоты

в составе белков (90% флуоресценции обеспечива-
ется триптофаном), некоторые витамины (рибофла-
вин), аллофикоцианин, фикоционин, фикоэритро-
цианин, белок зелёной флуоресценции (green fluo-
rescent protein - GFP), клонирован из тропической
медузы, стал распространенным инструментом –
репортером (меткой) экспрессии интересующих
генов.
2. Флуоресцентные красители. Продукты органическо-
го синтеза: флуоресцеининизотиоцианат (ФИТЦ),
родамин, кумарин и пр.
Безусловно, все красители обладают хорошей во-
дорастворимостью, фотостабильностью и неток-
сичны для клеток.

Слайд 17

Антрацен
Флуоресцеин
Родамин 6G
Структурные формулы некоторых флуорофоров
Большинство малых органических флуорофоров, нашедших практическое применение

в биологии – производные кумарина, флуоресцеина и родамина.

Слайд 18

3. Особой группой флуоресцентных соединений явля-
ются квантовые точки (полупроводниковые нано-
кристаллы).

При уменьшении физических размеров
частиц полупроводника до нанометровых ( 1-30 нм)
они начинают проявлять свойства, отличные от
объёмных полупроводников. В частности, речь идёт
о квантовых эффектах. При взаимодействии кванто-
вой точки с электромагнитныи излучением светового
диапазона образуется экситон (лат. excito — «возбу-
ждаю») . Экситон – водородоподобная квазичастица
(электрон и дырка). Рекомбинация экситонов (про-
цесс «гибели» электрон-дырочной пары в полупро-
воднике) приводит к высвобождению энергии.
Благодаря этому частицы нанометровых размеров,
образованные из таких полупроводниковых веществ,
как селенид кадмия (CdSe), способны поглощать свет
и фуоресцировать.

Слайд 19

Квантовые точки одного и того же химического стро-
ения, в зависимости

от своих размеров, дают флуорес-
ценцию с разной длиной волны при возбуждении одним
и тем же источником света.
Преимуществами квантовых точек над органическими
флуоресцентными красителями являются высокие
квантовые выходы флуоресценции и высокая устой-
чивость к фотообесцвечиванию. Т.о., для работы с
квантовыми точками не требуется особой аппаратуры,
можно обойтись обычным флуоресцентным микроско-
пом.

Слайд 20

Материалы, из которых изготавливаются квантовые
точки (Cd, Pb и др.)

токсичны для клеток. Для умень-шения токсичности применяется многоступенчатый
дизайн квантовых точек. Полупроводниковое ядро
покрывается двойной защитной оболочкой из род-
ственного материала (для CdSe - сульфид цинка) и гидрофильной полимерной оболочки, которая увели-чивает растворимость квантовой точки в водной среде и даёт возможность химически привязывать к её поверхности другие молекулы.

Слайд 21

Флуоресцентные вещества, применяемые в биоло-гии, можно условно разделить на две

большие группы:
1. Флуоресцентные метки - служат для идентифика-ции исследуемой молекулы или её пространственного положения. Метка должна быть химически стабильной и давать стабильную флуоресценцию, которая мало зависит от внешних факторов и минимально меняется во времени. Метка действует как пассивный «маяк», который сигнализирует о месте нахождения молекулы, к которой привязана. Наиболее распространёнными метками в современной клеточной и мол. биологии яв-
ляются флуоресцентные белки. Мечение белком зелё-ной флуоресценци является сегодня рутинной проце-дурой, используемой при изучении структуры и функций белков в различных модельных организмах.

Слайд 22

2. Флуоресцентные зонды. Это молекулярная конструкция, которая может существовать в двух со-стояниях:

«выключенном» и «включённом». Эти состояния различаются между собой определёнными параметрами флуоресцентной эмиссии (чаще всего квантовым выходом флуоресценции, позицией мак-симума в спектре эмиссии или временем жизни воз-буждённого состояния). Переход между состояниями «выключен» и «включён» зависит от наличия в среде тех молекул, которые зонд должен распознавать.

Слайд 23

Применение флуоресцентного зонда ПИРЕН для
изучения поступательного движения молекул в
биомембране

(оценка вязкости липидного бислоя)

300

400

500

λ, nm

Fλ/Fmax

excitation

emission

Спектры возбуждения и
флуресценции пирена

333

392 - мономер

470 - эксимер

Пирен в липидном бислое

Пирен свободно диффундирует в
толще липидного бислоя.
При увеличении «текучести» мемб-раны, чаще образуются эксимеры и F470 начинает преобладать над F392.

Образование эксимера
пирена из его мономеров

эксимер

Слайд 24

Тушение (гашение) флуоресценции.
Тушение флуоресценции происходит вследствие того, что излучаемая флуорофором

энергия передается молекулам других веществ, находящимся в этом же растворе: интенсивность флюоресценции снижается, вплоть до её полного подавления.
Для тушения требуется контакт между молекулами флуорофора и тушителя. При этом тушитель должен диффундировать к флуорофору в течение времени нахождения флуорофора в возбужденном состоянии.
В результате столкновения энергия возбуждения переходит в кинетическую энергию сталкивающихся частиц или в энергию возбуждения партнера. Эффективность тушения зависит от частоты столкновений, испытываемых возбужденным атомом.

Слайд 25

Основные факторы, вызывающие тушение флуоресценции
Увеличение температуры - температурное тушение.
С повышением

температуры частота столкновений возбужденных атомов с другими частицами возрастает, эффект тушения с ростом температуры также усилива-ется. В области комнатных температур выход флуорес-ценции обычно уменьшается на несколько %% с повы-шением температуры на 1 ºС.
2. Высокие концентрации - концентрационное туше-ние флюоресценции. Тушение проявляется при больших концентрациях частиц, когда длина свободного пробега мала, а частота столкновений, соответственно, велика. Тушение флуоресценции, вызванное столкновением молекул флурофора и тушителя, приводит к сокращению среднего времени жизни возбужденного состояния.

Слайд 26

3. Присутствие в растворе посторонних примесей,
которые могут изменить рН

раствора, что также
приводит к тушению флуоресценции. Для большин-
ства флюоресцирующих веществ характерен свой
интервал значений рН раствора, при которых возникает
флюоресценция (рН-оптимум для флуоресценции).

Слайд 27

Тушение флуоресценции описывается уравнением Штерна-Фольмера, имеющего свое графическое представление - график

Штерна-Фольмера

Fo и F - интенсивность флуоресценции в отсутствии и в присутствии тушителя (Q) соответственно; Q - тушитель (англ. quencher).

концентрация тушителя [Q]

Наклон графика = Кт (константа тушения флуоресценции)
1/Кт = концентрации тушителя, при
которой F0/F = 2, т.е. тушится 50%
интенсивности флуоресценции.

График линеен, если присутствует
один флуорофор. Если присутствуют
два типа флурофоров (с различной
доступностью для тушителя) – график
искривляется в сторону оси «Х».

Слайд 28

Для того, чтобы в полной мере реализовать высо-
кую чувствительность, свойственную

флуориметрии,
необходимо:
возбуждать флуоресценцию при максимуме погло-
щения;
регистрировать флуоресценцию при длине волны,
при которой интенсивность флуоресценции макси-
мальна.
Для количественно анализа требуется калибровоч-
ный график (Fф от С) или стандарт (раствор флуоро-
фора с известной концентрацией).

Флуоресцентная спектроскопия

Содержание

Люминесценция – способность многих органичес-ких и неорганических веществ к самостоятельному

Типы люминесценцииФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯсвечение под влиянием света (УФ- и видимого) Флуоресценция τ =

Флуоресценция (частный случай люминесценции), широко распространена в природе и может

Флуорофор – молекула или фрагмент молекулы, придающий ей флуоресцентные свойства. Как правило,

Флуорофоры

Природа флуоресценции (диаграмма Яблонского - энергия электронов в основном и возбужденном состояниях

Диаграмма ЯблонскогоSoS2S1fluorescenceτ = 10-15 с(τ = 10-8 с)

Устройство спектрофлуорметра (вид сверху)Монохроматор 1Выделяет λ, котораямаксимально поглощаетсявеществомМонохроматор 2Выделяет λ, прикоторой Fфмаксимальнаλ

Спектры возбуждения и спектры флуоресценции Спектр возбуждения - зависимость количества поглощенного

Спектры возбуждения и флуоресценциисдвиг СтоксаИз правого графика следует, что флуорофор будет

Спектры возбуждения (поглощения), как и спектры флуоресценции могут существенно меняться

Основные закономерности флуоресценцииФлуоресценция происходит при любой длине волны возбуждающего света.2. Q

Зависимость интенсивности флуоресценции (Fф) от концентрации веществаFф = Io x Q

Интенсивность флюоресценции (Fф) флуорофора линейно зависит от его концентрации (С)

Классификация флуорофоров:1. Биологические флуорофоры. Пиридиновые нукле- отиды (кофакторы), ароматические аминокислоты

АнтраценФлуоресцеинРодамин 6GСтруктурные формулы некоторых флуорофоровБольшинство малых органических флуорофоров, нашедших практическое применение

3. Особой группой флуоресцентных соединений явля- ются квантовые точки (полупроводниковые нано- кристаллы).

Квантовые точки одного и того же химического стро-ения, в зависимости

Материалы, из которых изготавливаются квантовые точки (Cd, Pb и др.)