Содержание
- 2. Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting) аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце.
- 3. Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания) Название вестерн-блот было дано технике У. Нейлом
- 4. протокол. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело». 1. Разделение белков методом SDS-PAGE гель-электрофореза/
- 5. «Твердая фаза» для иммуноблота пористые материалы типа нитроцеллюлозы (PVDF) в виде наполнителей в объеме или в
- 6. протокол. Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг. 4. Визуализация. Высокая степень разрешения достигается за
- 7. 5. Анализ. Количество белка оценивается с помощью денситометрии.
- 8. Подготовка образца Образец может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры. В большинстве случаев,
- 9. Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми.
- 10. Принцип электрофореза Предварительно денатурированные белки вносят в карманы «треков» (дорожек) акриламидного геля с низкой концентрацией (концентрирующий
- 11. Окрашивание гелей Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или
- 12. Анализ электрофоретического разделения белков В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля.
- 13. Выбор % разрешающего геля. концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля — чем выше концентрация акриламида, тем
- 14. Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской
- 15. Окрашивание белков на фильтре
- 16. Блокирование Как только выбрана мембрана, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению
- 17. Механизм блокирования Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой
- 18. Детекция. Непрямой и прямой WB преимущества • необходимость использовать только первичные антитела, что ускоряет процесс •
- 19. Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным). Раствор антител и мембрана
- 20. Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции. Антитела получают из животного источника и связываются с большинством первичных
- 21. Детекция. Другие методы детекции. Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает
- 22. Визуализация. Визуализация осуществляется с помощью гель-документирующих систем или цифровой камерой.
- 23. Анализ и представление результатов. На практике, не во всех вестернах обнаруживают белки лишь по одному бэнду
- 24. Анализ и представление результатов. Использование программного приложения Image J. Программного приложение Bio-Rad
- 25. Применение метода Вестерн-блоттинг используется в молекулярной биологииВестерн-блоттинг используется в молекулярной биологии, биохимииВестерн-блоттинг используется в молекулярной биологии,
- 26. Полный протокол 1. электрофорез 2. перенос 3. блокирование 4. инкубация с первичным антителом 5.отмывка 6.инкубация со
- 27. Применение в практической медицине Подтверждение инфицированности ВИЧ Диагностика клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) Диагностика сибирской язвы Диагностика
- 33. Скачать презентацию