Методы выделения и анализа биологически активных веществ

Слайд 3

Методы разрушение клеток
(гомогенизация)

Слайд 4

Образование различных веществ в ходе периодического роста Clostridium acetobutylicum при рН

5; приведены экспериментально найденные концентрации клеточной массы, масляной кислоты, бутанола.

Слайд 5

Способы разрушения клеток

Слайд 6

Слайд 7

Слайд 8

Слайд 9

Пестиковый ручной гомогенизатор
1 – пестик; 2 – корпус; 3 –

мотор; 4 – штатив

Гомогенизатор Даунса (Dounce)

Слайд 10

ROTOR-STATOR MILL

Слайд 11

Механический лопастной гомогенизатор и шаровая мельница
1 – корпус с электродвигателем и

пусковым устройством;
2 – камера для измельчеия материала

Слайд 12

1 – корпус с электродвигателем и пусковым устройством;
2 – камера

для измельчения материала

Application volumes 0.05 - 250 ml

Manual Disperser

Applications
General homogenization applications (dispersion and emulsification)
Homogenising of tumour tissue sample, for research of diverse tissue diseases
Fast dissolving of pills, sugar-coated tablets for quality control purposes
Sample preparation for subsequent extraction of pharmaceutical agents
Cell disruption, RNA / DNA isolation from tissue
Dispersion of small quantities from plants, animals or human tissue
Solving of solid materials

Механический лопастной гомогенизатор

❶

❷

Слайд 13

1 – корпус с электродвигателем и пусковым устройством;
2 – камера

для измельчеия материала

Application volumes 0.05 - 250 ml

Manual Disperser

Механический лопастной гомогенизатор

Слайд 14

ШАРОВАЯ МЕЛЬНИЦА

Слайд 15

3D гомогенизаторы
Технология основана на растирающем действии лизирующих частиц при 3D-движениях вибрационного

ротора. Высокоэффективный принцип позволяет гомогенизировать и лизировать образец любой сложности в считанные секунды.

Слайд 16

3D гомогенизаторы

Слайд 17

Ультразвуковой дезинтегратор
Cell suspension
Ultrasound
generator
Ultrasound tip

Слайд 18

Ячейка пресса Френча

Слайд 19

Ячейка пресса Френча
Пресс Френча

Слайд 20

1. Ткани животных
Ткань разрезают на кусочки, удаляют, насколько это возможно, соединительную

ткань и жир. Разрезанную ткань помешают в лопастной гомогенизатор, добавляют 2-3 объема холодного экстрагирующего буфера в расчете на 1 г ткани. Смесь гомогенизируют в течение 30 с; гомогенизацию повторяют, если остались куски неразрушенной ткани. При доведении рН до нужного значения перемешивают гомогенат 10-15 мин, а затем переносят его в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5000-10000g 60 мин.
Экстракт сливают через фильтр, марлю или стеклянную вату для удаления частиц жира.
2. Эритроциты
Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором NaCl (0,9%, 0,15 М). Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема на воды на 1 объем отцентрифугированных клеток).

Некоторые примеры

Слайд 21

3. Мягкие растительные ткани
К растительной ткани добавляют только 0,5-1 объем

холодного буфера, содержащего 20‑30 мМ меркаптоэтанола. и гомогенизируют в лопастном гомогенизаторе в течение 30 с. Вместо этого можно пропустить материал через бытовую соковыжималку или натереть на терке. Гомогенат следует отцентрифугировать как можно скорее, чтобы уменьшить его потемнение в результата окисления. Жидкость осторожно сливают с поверхности осадка.
4. Дрожжи
1. Полностью разрушить клетки можно с помощью гомогенизатора Мэнтона-Гаулина, используя около двух объемов буфера на 1 г сырой массы.
2. Автолиз толуолом. Применяют различные методы с использованием толуола. В основе этих методов лежит обработка дрожжей толуолом, обычно при температуре 35-40°С. Через 20-30 мин дрожжи "разжижаются" вследствие экстракции компонентов клеточной стенки. После этого к дрожжам добавляют буфер и перемешивают их в течение нескольких часов или оставляют на ночь на холоде. Так как метод автолитический и структуры клеточной стенки разрушаются под действием ферментов, во время обработки может произойти деградация некоторых клеточных белков.

Слайд 22

5. Бактерии
Бактериальные клетки можно разрушить ультразвуком, с помощью шаровой мельницы

или пресса Френча, хотя не все эти способы удобны для приготовления больших объемов экстракта. В случае небольших объемов клетки можно растирать с окисью алюминия.
Грамположительные бактерии обычно чувствительны к лизоциму. (Bacillus). Грамотрицательные бактерии, если их предварительно не обрабатывать, менее чувствительны к лизоциму (E. coli).

Извлечение мембранных белков
При извлечении белков связанных с мембранами эффективным является применение детергентов. Часто для этой цели используется мягкий неионный детергент Тритон Х-100. Детергенты способны растворить клеточную мембрану и солюбилизировать белок сохранив при этом его целостность.

Слайд 23

Центрифугирование

Слайд 24

Основы теории седиментации
Частица (в том числе и макромолекула) в пробирке вращающегося

ротора испытывает действие радиально направленной центробежной силы Fц.

, где

ρ и ρс — плотность соответственно частицы и среды, г/см; V — объем частицы, см3.

M — действующая масса частицы, г;
— угловая скорость вращения, рад/c;
r — радиус вращения, см.

, где

Слайд 25

Основы теории седиментации
Частица движется вдоль радиуса со скоростью v (см/c), при

этом сила трения действует в обратном направлении:

, где f — коэффициент трения.

Таким образом:

Слайд 26

Основы теории седиментации
Скорость частицы под действием центробежной силы будет нарастать до

тех пор, пока сила трения не уравновесит центробежную силу (после этого скорость станет постоянной):

Слайд 27

Основы теории седиментации
От угловой скорости вращения ω легко перейти к угловой

скорости n в об/мин или N тыс. об/мин:

, где

Слайд 28

Основы теории седиментации
Выводы из рассмотренной зависимости:
При одинаковых плотностях частицы большего размера

оседают быстрее чем мелкие (D).
Скорость оседания пропорциональна плотности частицы, особенно сильно это проявляется когда плотность частицы и среды близки.
Скорость оседания пропорциональна квадрату числа оборотов ротора.
Скорость оседания обратно пропорциональна вязкости среды.
Скорость оседания пропорциональна расстоянию от оси вращения. Это расстояние увеличивается по мере оседания и следовательно возрастает скорость. Если это почему-либо нежелательно следует создать градиент плотности среды так, что бы она увеличивалась по мере удаления от оси.

Слайд 29

,
Коэффициент седиментации

Слайд 30

Плавучая плотность частиц
Плотность частицы обусловлена не только ее химическим составом и

пространственной структурой, но и количеством прочно связанной с ней воды. Эта вода движется вместе с частицей, значительно уменьшая ее эффективную плотность. Количество связанной с частицами воды уменьшается в присутствии высокой концентрации ионов и гидрофильных молекул. Они связывают воду, тем самым препятствуя гидратации частиц. С другой стороны, некоторые ионы или молекулы могут прочно связываться с частицами, увеличивая, как правило, их эффективную плотность.
Таким образом, эффективная плотность частиц, определяющая скорость их оседания, сильно зависит от химической природы и концентрации веществ, растворенных в среде, в которой ведется центрифугирование. Поэтому для данных частиц в данной среде вводят понятие «плавучей плотности». Ее можно определить экспериментально, измерив плотность среды, в которой движение частиц прекращается, как только разность ρ-ρс становится равной нулю.
Плавучая плотность частиц определенной химической природы может изменяться очень сильно. Например, плавучая плотность ДНК в воде составляет примерно 1,1 г/см3, а в концентрированном растворе CsCl - около 1,7 г/см3. Плавучая плотность как и степень гидратации зависит от температуры (также как плотность и вязкость).

Слайд 31

Центробежное ускорение и относительное центробежное ускорение
Шкалы центрифуг калиброваны в тех или

других единицах, иногда. и в тех и в других, часто есть таблицы соответствия. Условия центрифугирования так и описывают 5000 об/мин, 30 мин или 7500g, 15 мин.
Правильнее приводить значение относительного центробежного ускорения, однако оно зависит от радиуса вращения и принято рассчитывать его для rmax. Хотя при попытке воспроизведения условий центрифугирования приведенных таким образом на другом роторе будут получены несколько отличные параметры. Если же приводятся обороты в минуту, то отличия на разных роторах будут больше, хотя обычно и не очень значительны.

Условия центрифугирования описывают двумя параметрами один из которых время, а второй угловая скорость в об/мин или относительное центробежное ускорение. Относительное центробежное ускорение это отношение центробежного ускорения к ускорению силы тяжести Земли:

Слайд 32

Центрифуги
Ультрацентрифуги –
скорости вращения 50-80 тыс. об/мин
Высокоскоростные центрифуги – скорости вращения

20-50 тыс. об/мин

Обычные центрифуги –
скорости вращения менее 20 тыс. об/мин

Слайд 33

Схема углового ротора
Ротор с вертикальным расположением пробирок
Типы роторов

Слайд 34

Угловой ротор
Типы роторов

Слайд 35

Ротор с вертикальным
расположением пробирок
Типы роторов

Слайд 36

Типы роторов
Бакет ротор – ротор со свободно подвешенными пробирками

Слайд 37

Типы роторов
Бакет ротор – ротор со свободно подвешенными пробирками

Слайд 38

Типы роторов
Зональный ротор с переходным устройством
Схема работы проточного зонального

ротора
1-3 – формирование градиента плотности
4 – введение образца
5 – разделение
6 - отбор фракций после разделения

Слайд 39

Размещение пробирок в роторах
Ротор должен быть уравновешен

Слайд 40

Методы центрифугирования

Слайд 41

Раздельное осаждение частиц.
Дифференциальное центрифугирование
Скорость оседания частиц определяется их размером. Крупные

оседают быстрее, мелкие – медленнее. Можно подобрать условия (время и скорость вращения ротора) так, что более крупные частицы осядут, а мелкие почти целиком останутся в супернатанте.

Слайд 42

$Subcellular fractionation of tissue Differential centrifugation$

Subcellular fractionation of tissue
Differential centrifugation

Слайд 43

Зонально-скоростное центрифугирование
Эффективный способ подавления конвекции создания градиента плотности среды с увеличением

вдоль радиуса вращения от центра к периферии.

Зональное - частицы разного размера оседают более или менее ограниченными слоями - зонами. Скоростное - частицы разделяются по скорости оседания.

Слайд 44

Устройство для создания линейного градиента плотности раствора.
1 – резервуар
2 – смеситель

Слайд 45

Фракционирование зон

Слайд 46

Равновесное (изопикническое) центрифугирование

Слайд 47

Равновесное (изопикническое) центрифугирование
Особенности разделения:
Процесс центрифугирования должен быть длительным, так как при

подходе к положению равной плотности (изопикническому положению) частицы будут двигаться замедленно.
2. Вязкость среды вследствие этого является нежелательным фактором.
3. Размеры частиц и, следовательно, их масса не скажутся на окончательном распределении. Положение на градиенте определяется только их плотностью, хотя начальная скорость миграции из области иной плотности градиента будет больше у тяжелых частиц.

Слайд 48

Равновесное (изопикническое) центрифугирование
Особенности разделения:
4. Частицы будут двигаться к положению равновесия

как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом, наряду с седиментацией, может происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата и можно даже смешать его со всем объемом градиента.
5. Из п.4 следует, что при равновесном центрифугировании допускается более высокая емкость загрузки препаратом, чем при зонально-скоростном.

Слайд 49

Вещества, используемые для формирования градиента плотности при изопикническом центрифугировании
1. Элементоорганические

соединения содержащие тяжелые атомы

2. Соли металлов с «большими ионами»

NaI, КI, CsCl, Cs2SO4, RbCl,
CCl3COOCs, CCl3COORb

метризамид

При достаточно больших скоростях вращения ротора молекулы этих веществ оседают под действием центробежной силы, создавая градиент плотности, нарастающий от мениска ко дну пробирки.

Слайд 50

Under high centrifugal force, a solution of cesium chloride (CsCl) molecules

will dissociate.The heavy Cs+ atoms will be forced away from the center towards the outer end of the tube, but will at the same time diffuse back towards the top of the tube, thus forming a shallow density gradient. DNA molecules placed in this gradient will migrate to the point where they have the same density as the gradient (the neutral buoyancy or isopycnic point). The gradient is sufficient to separate types of DNA with slight differences in density due to differing [G+C] content, or physical form (e.g., linear versus circular molecules).
In the experiment above, after centrifugation for 10 hrs at 100,000 rpm (450,000 x g), two distinct bands, corresponding to sheared linear nuclear DNA above and circular mitochondrial DNA below, are visible under ultraviolet light. The DNA has been mixed with the intercalating dye ethidium bromide, which enhances the density difference between the two forms and causes the DNA to fluoresce. The separate bands are collected by poking a hole in the bottom of the tube. The intact mtDNA is available for further biological analysis.

Preparative density-gradient ultracentrifugation of DNA (SM Carr & OM Griffiths.1987. Biochem Genet 25:385-390)

Слайд 51

Diagrammatic representation of rate zonal and isopycnic centrifugation.
ρ1 = buoyant density

of the less dense (blue) particles
ρ2 = buoyant density of the more dense (red) particles

Слайд 52

Density Marker Beds в градиентах Percoll’а (Pharmacia)
Стартовая плотность 1,07 г/мл

в 0,15 М NaCl. Центрифугирование при 20000 g

15 мин

30 мин

60 мин

90 мин

Percoll представляет собой частицы силикагеля 15-30 нм диаметром «одетые» недиализующимся поливинилпирралидоном и предназначен для разделения клеток, клеточных органелл и вирусов. Percoll способен формировать градиент протности в диапазоне 1-1,3 г/мл.

Слайд 53

Isometric gradient formation by Percoll in an anglehead rotor, 8 x

14 ml (MSE Superspeed centrifuge) starting density 1.07 g/ml in 0.15 M NaCl. Running conditions: 20,000 x g for 15, 30, 60 and 90 minutes. Gradient density was monitored by means of colored Density Marker Beads.
(Work from Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden).

Слайд 54

Использование угловых и вертикальных роторов не мешает созданию градиента плотности и

даже предпочтительно, т.к. уменьшает время проведения эксперимента за счет уменьшения длины градиента.

Слайд 55

Разделение осаждением
Распределение зарядов и гидрофобных областей на поверхности молекулы типичного белка

Слайд 56

Изоэлектрическое осаждение
Растворимость белка при значениях pH, близких к изоэлектрической точке
Изоэлектрическая

точка – значение pH, при котором молекула полиэлектролита неподвижна в электрическом поле.

Слайд 57

Высаливание
Высаливание - осаждение при высокой концентрации соли
Упорядоченное расположение молекул

вокруг гидрофобных участков на поверхности белка

Слайд 58

Высаливание
Для высаливания белков наиболее эффективны те соли, анионы которых имеют

большой заряд, например, сульфат, фосфат, цитрат. Катионы в этом отношении сравнительно менее важны.

(NH4)2SO4

Cульфат аммония – наиболее широко используемый осадитель.

Ряд Гофмейстера – влияние ионов на растворимость белков

Слайд 59

Осаждение органическими растворителями
Осаждение белков и нуклеиновых кислот смешивающимися с водой органическими

растворителями, такими как ацетон, этанол или изопропанол.

Acetone precipitation of proteins
Cool the required volume of acetone to -20°C.
Place protein sample in acetone-compatible tube.
Add four times the sample volume of cold (-20°C) acetone to the tube.
Vortex tube and incubate for 60 minutes at -20°C.
Centrifuge 10 minutes at 13,000-15,000 × g.
Decant and properly dispose of the supernatant, being careful to not dislodge the protein pellet.
Allow the acetone to evaporate from the uncapped tube at room temperature for 30 minutes. Do not over-dry pellet, or it may not dissolve properly.
Add buffer appropriate for the downstream process and vortex thoroughly to dissolve protein pellet.

Слайд 60

Мембранные методы разделения
Диализ и ультрафильтрация

Слайд 61

Диализ
Диализ - отделение низкомолекулярных соединений от высокомолекулярных за счет действия осмотических

сил

Основные области применения диализа обессоливание и замена буфера

Распределение целлюлозных волокон в диализной мембране

Слайд 62

Диализ
Диализ – отделение низкомолекулярных соединений от высокомолекулярных за счет действия осмотических

сил

Основные области применения диализа обессоливание и замена буфера

Слайд 63

Слайд 64

Ультрафильтрация
Ультрафильтрация - метод разделения мелких частиц (молекул) в растворах или коллоидных

системах с помощью полупроницаемых мембран под давлением.

Перемешиваемая ультрафильтрационная ячейка

Слайд 65

Ультрафильтрация
Ультрафильтрация - метод разделения мелких частиц (молекул) в растворах или коллоидных

системах с помощью полупроницаемых мембран под давлением.

Слайд 66

Ультрафильтрационные мембраны
Номинальный предел молекулярной массы (nominal molecular weight limit - NMWL)

- максимальная молекулярная масса белка или полисахарида, молекулы которого проходят через мембрану.

Ультрафильтрация может быть использована для фракционирования молекул по размеру, а также, подобно диализу, для обессоливания растворов высокомолекулярных соединений и замены буфера. Однако наиболее распространенное приложение ультрофильтрации – концентрирование растворов высокомолекулярных соединений без увеличения содержания низкомолекулярных веществ.

Millipore (Amicon)
GE Heathcare
(Amersham)

Слайд 67

Ультрафильтрационные мембраны
NMWL

Слайд 68

Оборудование для ультрафильтрации
Перемешиваемая ячейка
(Stirred cell)
Стандартные рабочие объемы 3-500 мл

Слайд 69

Ультрафильтрационные патроны для центрифуг
Рабочие объемы как правило не превышают 15 мл

Слайд 70

Ультрафильтрационные патроны для центрифуг
Рабочие объемы как правило не превышают 15 мл

Слайд 71

Тангенциальная (cross flow) ультрафильтрация

Слайд 72

Тангенциальная (cross flow) ультрафильтрация
Лабораторные системы начального уровня позволяют сконцентрировать 2 литра

раствора белка до 50 мл за 1 час.

Могут использоваться плоские мембраны или полые волокна.
Объем обрабатываемого раствора практически не ограничен.

Методы выделения и анализа биологически активных веществ

Содержание