Репликация ДНК и РНК

ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
КАК ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Хранение, передача и реализация генетической информации

Хранение –

Центральная догма молекулярной биологии

Фрэнсис Крик
(Francis Harry Compton Crick)
1916 - 2004

ДНК

РНК

Белок

ДНК

РНК

Белок

Crick, F.H.C.

ДНК

Хранение и передача нуклеиновыми кислотами генетической информации
в неизменном виде

Репликация
Удвоение ДНК в ходе деления клетки

2n

4n

2n

2n

Репликация – удвоение ДНК

Репликация

+

Модели репликации

Репликация

Консервативный
механизм

Полуконсервативный
механизм

Дисперсивный
механизм

+

+

+

Полуконсервативный механизм репликации

Репликация

Мэтью Стэнли Мезенсон
Matthew Stanley Meselson
1930 г.р.

Франклин Уильям Сталь
Franklin William

Эксперимент Мезельсона-Сталя (PNAS.-1958.-44:671-682)

Репликация

14N - 99,635 % и 15N - 0,365 %

15NH4Cl

E.coli

E.coli

14NH4Cl

ДНК
cодержит

Репликация

Формирование градиента плотности
CsCl (исходная концентрация 7.75 М) и
образование узкой зоны ДНК

Репликация

Зоны ДНК, очищенной из E.coli после
выращивания с 15NH4Cl и c 14NH4Cl.
Разница

Репликация

ДНК из E.coli после выращивания с 15NH4Cl

ДНК из E.coli после

Репликация

Что доказывает эксперимент Мезельсона-Сталя?

0

1

2

3

Дисперсивный
механизм

15N

15N

14N

15N

14N

15N

14N

15N

14N/15N

14N

14N

14N/15N

14N/15N

15N

14N/15N

14N/15N

14N/15N

Полуконсервативный механизм репликации

Репликация

Точка начала репликации и репликационные вилки

ori

Репликация ДНК бактерий

+

Репликационная вилка

13-19 мин

Репликация

Точка начала репликации и репликационные вилки

ori

ori

Эксперимент с меченными нуклеотидами разной

Репликация

Репликация кольцевой ДНК
механизм «катящегося кольца»

Дочерняя ДНК

Репликация

Репликация ДНК эукариот
множественные точки начала репликации

ori

ori

ori

Небольшое отступление

Кольцевая и псевдокольцевая ДНК

Надцарство прокариот
(3.5 млрд. лет)

Надцарство эукариот
(1.5-2 млрд. лет)

©

1. Оксидоредуктазы
2. Трансферазы
3. Гидролазы
4. Лиазы
5. Изомеразы
6. Лигазы

Небольшое отступление

A(окисл) + B(восст) →

Репликация

ДНК-полимераза
(трансфераза)

α-[32P]-дезоксирибонуклеотиды

α-[32P]-дАТФ

α-[32P]-дГТФ

α-[32P]-дЦТФ

α-[32P]-дТТФ

+ экстракт E.coli

Очистка ДНК

Измерение
радиоактивности
ДНК

Очистка белков

Освновной принцип – обогащение раствора требуемым белком

Избирательное осаждение

Очистка белков

Избирательное осаждение белков

Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от pH

-H+

+H+

-H+

+H+

pH <

Избирательное осаждение белков

Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от pH

pH < 6

6

Избирательное осаждение белков

Изоэлектрическая точка и зависимость растворимости от pH

+

+

+

+

+

+

–

–

–

–

–

–

+

+

pH < pI

pH

Избирательное осаждение белков

Высаливание

В водном растворе белки связывают часть молекул воды.
При замораживании

Избирательное осаждение белков

Высаливание

Гидрофобные участки
на поверхности белка

Гидратная оболочка белка

Белки, имеющие гидратную оболочку,
находятся

Избирательное осаждение белков

Высаливание

Очистка белков

Избирательное осаждение белков

Денатурация
(удаление из смеси ненужных белков)

pH (сильный сдвиг)

Температура

Органические растворители

Денатурация
(потеря третичной

Хроматография (гель-фильтрация)

OD

Очистка белков

Репликация

ДНК-полимераза

Фракция, обогащенная белком
(ДНК-полимеразой)

Экстракт ткани

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные дезоксирибонуклеотиды

Инкубируем

Удаляем нуклеотиды

В

Удаляем
нуклеотиды

Удаляем
нуклеотиды

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды

Инкубируем

Радиоактивность в растворе
не обнаруживается

Следовательно, полученная

Добавляем фракцию, обогащенную белком

Добавляем радиоактивно меченные рибонуклеотиды

Инкубируем

Следовательно, для синтеза ДНК нужна

Репликация

ДНК-полимераза
(трансфераза)

(дNМФ)n + дNТФ

(дNМФ)n+1 + PPi

ДНК-полимераза

ДНК-матрица

ДНК-матрица

Дочерняя ДНК

ДНК-полимераза требует наличия матрицы (материнской ДНК).
ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеозидмонофосфат в соответствии с

P

G

5’

3’

5’-pApCpGpTpC-3’

P

P

A

C

P

C

P

T

3’

5’

Первичная структура ДНК

ДНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК

Репликация

ДНК-полимераза

5’

5’

3’

3’

Для работы ДНК-полимеразы требуется расплетание двухцепочечной

ДНК-полимераза не может начать синтез ДНК с первого нуклеотида, она присоединяет

Репликация

ДНК-полимераза

ДНК-полимераза присоединяет дезоксирибонуклеотидмонофосфат
к 3’-ОН группе дезоксирибозы

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Дочерняя нить ДНК растет в направлении

Репликация

Лидирующая и отстающая нити ДНК

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Лидирующая нить

Отстающая нить

С отстающей нитью связывается праймер

Репликация

Фрагменты Оказаки

Рэйдзи Оказаки
(Reiji Okazaki)
1930—1975

Цунэко Оказаки
(Tsuneko Okazaki)
1933 г.р.

Ультрацентрифугирование ДНК в щелочном градиенте

Репликация

Фрагменты Оказаки

Фрагменты Оказаки

Вырезание праймеров
и застройка бреши

Репликация

Этапы репликации

Расплетание ДНК
Синтез праймера для начала считывания лидирующей цепи
Синтез нуклеотидов +

Репликация

Этапы репликации

Расплетание ДНК

Топоизомераза (изомераза)

Хеликаза (гидролаза)

5’

5’

3’

3’

Белки SSB (single strand binding protein)

Топоизомераза

Хеликаза

SSB

Репликация

Этапы репликации

Синтез праймера для начала считывания лидирующей цепи

Праймаза – ДНК-полимераза α

Репликация

Этапы репликации

Синтез нуклеотидов

АДФ
ГДФ
ЦДФ

Рибонуклеотид редуктаза
(оксидоредуктаза)

дАДФ
дГДФ
дЦДФ

Нуклеозид-дифосфат киназа
(трансфераза)

дАТФ
дГТФ
дЦТФ

УДФ

Рибонуклеотид редуктаза
(оксидоредуктаза)

дУДФ

Фосфатаза
(гидролаза)

дУМФ

Тимидилат
синтаза
(трансфераза)

дТМФ

дТДФ

дТТФ

Тимидилат киназа
(трансфераза)

Нуклеозид-дифосфат киназа
(трансфераза)

Репликация

Этапы репликации

Синтез ДНК на лидирующей цепи
ДНК-полимераза ε (трансфераза)

5’

5’

3’

3’

ДНК-полимераза ε

Репликация

Этапы репликации

Синтез праймеров для отстающей цепи

5’

5’

3’

3’

Праймаза – ДНК-полимераза α (трансфераза)

Праймаза

Репликация

Этапы репликации

5’

5’

3’

3’

Синтез нуклеотидов + синтез фрагментов Оказаки

ДНК-полимераза δ (трансфераза)

ДНК-полимераза δ

Репликация

Этапы репликации

Продвижение репликационной вилки (~1000 п.н.)

Репликация

Этапы репликации

Синтез праймеров для отстающей цепи

Праймаза – ДНК-полимераза α (трансфераза)

Репликация

Этапы репликации

Синтез нуклеотидов + синтез фрагментов Оказаки

ДНК-полимераза δ (трансфераза)

Репликация

Этапы репликации

Вырезание праймеров

ДНК-полимераза δ вытесняет РНК праймер
Эндонуклеаза (гидролаза)
отрезает праймер

Эндонуклеаза
(гидролаза)

Однонитевой
разрыв

Репликация

Этапы репликации

Вырезание праймеров

ДНК-лигаза (лигаза) застраивает одноцепочечный разрыв

ДНК-лигаза

Репликация

Скользящий зажим

Белок β (E.coli)
PCNA (эукариоты)

Открытый зажим

Закрытый зажим

Закрытый зажим
в зоне перехода от

Репликация

Скользящий зажим

Белок β и двухцепочечная ДНК

Белок β

PCNA

Репликация

Скользящий зажим

+ PPi

Репликация

Скользящий зажим

ДНК-полимераза

Репликация

Работа реплисомы

TRENDS in Microbiology 2007 Vol.15 No.4 P.156-164

Репликация

Выпетливание отстающей цепи

Репликация

3’→5’ экзонуклеазная активность ДНК-полимераз

Одна ошибка на 105-106 н.

Увеличение точности
в 10-100 раз

ДНК-полимеразы

Репликация

Проблема концов хромосом эукариот

Маргинотомия (1971)

Лимит Хайфлика (1961)

Нормальные (не опухолевые) клетки человека

Репликация

Теломеры

τέλος — конец и μέρος — часть

Концевые участки хромосом

(TTAGGG)n

5’

5’

3’

5’

Теломерный нуклеопротеидный комплекс

Репликация

Теломеры

Укорачивание теломеров до n < 13 вызывает слияние хромосом.
Укорачивание теломеров приводит

Репликация

Теломераза

РНК-зависимая ДНК-полимераза (трансфераза)

Добавляет фрагменты TTAGGG к 3’-концу хромосомы

CAAUCCCAAUC

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

CAAUCCCAAUC

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

http://www.uic.edu

Репликация

Теломераза

Нобелевская премия 2009 г.
за открытие механизмов защиты хромосом теломерами
и фермента теломеразы

Клеточный цикл

© Aaron Straight, Stanford University School of Medicine

Интерфаза (I)

Митоз

Интерфаза

Метафаза

Профаза

Прометафаза

Анафаза

Телофаза

Клеточный цикл

Митоз

Alberts Bю et al. Molecular Biology of the Cell. 4th

Размер клетки

Время

I

M

I

M

Клеточный цикл

Интерфаза

Циклическое изменение размера делящейся клетки

Клеточный цикл

Интерфаза

Потребление клеткой
дезоксинуклеотидов

Время

S
фаза синтеза

G1
1-я проме-
жуточная
фаза

G2
2-я проме-
жуточная
фаза

S
фаза синтеза

G1
1-я проме-
жуточная
фаза

G2
2-я проме-
жуточная
фаза

I

M

I

M

Циклическое изменение потребления

Клеточный цикл

G0

G1

G2

G0

S

M

Alberts B. et al. Molecular Biology of the Cell. 4th

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

http://www.cbp.pitt.edu/faculty/yong_wan/index.html

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

Проточная цитофлуориметрия

Спектр поглощения

Спектр излучения

Длина волны

Интенсивность

DAPI

FITC

Флуоресцентное окрашивание

Количество ДНК
в одной клетке

Время

S
фаза синтеза

G1
1-я проме-
жуточная
фаза

G2
2-я проме-
жуточная
фаза

S
фаза синтеза

G1
1-я проме-
жуточная
фаза

G2
2-я проме-
жуточная
фаза

I

M

I

M

Клеточный цикл

Исследование

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

Проточная цитофлуориметрия

Схема прибора

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

Проточная цитофлуориметрия

Окрашивание клеточной ДНК
йодистым пропидием

PI

Интенсивность
флуоресценции

Количество клеток

A

B

C

A ≈ B
C

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

Интенсивность
флуоресценции

Количество клеток

2n

4n

Окрашивание клеточной ДНК
йодистым пропидием

Количество ДНК
в одной клетке

Время

S
фаза

Клеточный цикл

Исследование клеточного цикла

Проточная цитофлуориметрия

Переход клеток
в фазу G0

Типичные гистограммы окрашивания ДНК
при

Репликация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Матрица

Симуляция работы хеликазы
Симуляция работы праймазы
Полимеризация ДНК

…

Репликация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Симуляция работы хеликазы
Плавление ДНК

96°С

Репликация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Симуляция работы праймазы

Подбор и заказ праймеров

Отжиг праймеров

Репликация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеризация ДНК

Thermus aquaticus

Wikimedia Commons

ДНК-полимераза Taq

Tопт = 72°С

Репликация

ПЦР

1-й цикл

Плавление

Отжиг

Полимеризация

1 матрица (2 нити) + 1 полупродукт (2 нити)

Репликация

ПЦР

2-й цикл

Плавление

Отжиг

Полимеризация

1 матрица (2 нити) + 2 полупродукта (4 нити) +

Репликация

ПЦР

3-й цикл

Плавление

Отжиг

Полимеризация

1 матрица (2 нити) + 3 полупродукта (6 нитей) +

Репликация

ПЦР

Матриц - 1

Полупродуктов – n

Продуктов – 2n-(n+1)

Метод ПЦР позволяет определить наличие