Фотометрические методы биохимического анализа

Июль 24, 2022

Главная
Медицина
Фотометрические методы биохимического анализа

Содержание

2. ИЗМЕРЕНИЕ ПО КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ
3. Методы сравнения стандартного и опытного образца Анализируемая и стандартная проба обрабатываются в одинаковых условиях При больших
4. Методы определения без использования калибратора Фотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора – средние молекулы, серомукоид) –
5. Методы определения без использования калибратора Определение концентрации по молярному показателю поглощения – применение закона Бургера С
6. Спектральные характеристики хромогенов
7. Примеры: Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотности Молярный показатель НАДН при 340 нм 6,22х10
8. Измерение скорости изменения поглощения Фотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакции Потребление субстратов Повышение концентрации продуктов
9. НАДН и НАДФН имееют максимум поглощения при λ 340 нм НАДН и НАДФН имееют максимум поглощения
10. Сопряженные реакции Аланин + α-КГ → Пируват + Глутамат Пируват + НАДН → Лактат + НАД
11. При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минуту F х А – активность фермента (МЕ,
12. Единицы активности ферментов Катал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за 1 сек МЕ -
13. Измерение по конечной точке Реакция развивается за некоторый период времени и достигает определенного конечного состояния (конечная
14. 1-точечное измерение на двухлучевом фотометре Измерение ведется в режиме сравнения растворов в двух кюветах В каждую
15. Измерение с бланком на однолучевом фотометре Для исключения систематического влияния (рабочий реактив, отражение от стенок кювет,
16. Рабочая таблица для определения концентрации методом измерения с бланком по рабочему реактиву
17. Измерение с прозоной Разновидность измерения с бланком Измерение в одной кювете, отсутствует кювета сравнения Проводят определение
18. Двухволновое измерение с опорной длиной волны Необходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз, иктеричность, липемичность, использование исчерченных
19. Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки 20 мкл сыворотки, смешать с 200
21. Кинетические измерения Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности Широко используется для определения активности ферментов Требует
22. Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментов Коэффициенты имееют ориентировочный характер, т.к. зависят также от буфера, рН,
23. Измерение по кинетике А - скорость постоянна, в любой период можно по скорости реакции оценивать активность
24. Измерение по двум точкам При постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить на любом отрезкелинейной кривой,
25. Измерение по двум точкам Возможны методические ошибки Если реакция начинается с очень высокой скоростью, то она
26. Измерение по двум точкам Реакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных системах) Обусловлена, по-видимому, задержкой
27. Многоточечное измерение Позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок Является наиболее точным методом
28. Многоточечное измерение Измерение по начальной скорости Скорость увеличивается в зависимости от количества фермента при одинаковой начальной
29. Измерение по начальной скорости Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент времени светопропускания. Показатель, соответствующий
30. Многоточечное измерение Кинетический метод с коррекцией по бланку образца Используется для определения активности ферментов и количественного
31. Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества
32. Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Схема однолучевого метода измерения оптической плотности исследуемого раствора относительно раствора
33. Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование Оптическая плотность исследуемого и сравнительного образцов измеряется одновременно
34. Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Двухлучевое фотометрирование Оптическая плотность исследуемого и сравнительного образцов измеряется одновременно
35. Двухлучевое фотометрирование Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Разделение 2-х лучей во времени с одним монохроматором,
36. Волоконный световод минимизирует оптическую схему
37. Основные элементы биохимического анализатора
38. Двухлучевое фотометрирование Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов Разделение 2-х лучей во времени с одним монохроматором,
39. Рассеяние света Мутный раствор в кювете - поглощает свет (если окрашен) - частично проходит, не изменяя
40. Рассеяние света Трансмиссия и рассеивание зависят от - длины волны светового потока - частоты светового потока
41. Определение светорассеивания Зависит от длины волны (λ) Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание Если размер частиц
42. Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея Ir и I0 – интенсивность рассеянного и падающего
43. В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции Рассеяние света каждой частицей не зависит друг от
44. При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным Максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча
45. При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается Характерен для взвеси бактерий, клеток
46. Нефелометрия Измерение рассеянного света Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию вещества в растворе
47. Оптическая схема нефелометра 1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная пластинка, разделяющая свет на
48. Турбидиметрия Измерение прошедшего света Турбидиметры построены по типу фотометров Интенсивность прошедшего светового потока определяется уравнением I0
49. Турбидиметрия Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов t – молярный коэффициент мутности раствора (турбидность) В
50. Турбидиметрия и нефелометрия Используются для определения индивидуальных белков Особенность – построение калибровочного графика с использованием не
51. Кривая доза-эффект При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты При постоянной концентрации антител при невысокой концентрации антигена все
52. При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок – преципитат. В супернатанте не определяются
53. При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка. Частицы иммунных комплексов становятся мелкими,
54. Кривая доза-эффект Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля Зона избытка антител – величина преципитатов увеличивается по мере добавления
55. Калибровочный график Строится для -каждого индивидуального белка -каждого прибора -при любом условий регистрации -периодически при проведении
56. 1- если после добавления антигена реакция ускоряется, имеет место избыток антител (измерение проводится правильно) Состав реакционной
57. Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества
58. Спасибо за внимание
59. КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР
60. Спектрофотометр без монохроматора
61. Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой
63. Спектр поглощения производных гемоглобина спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина (HbH); 2 – карбоксигемоглобина (HbCO)
65. Скачать презентацию

Слайд 2

ИЗМЕРЕНИЕ ПО КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ

Слайд 3

Методы сравнения стандартного и опытного образца
Анализируемая и стандартная проба обрабатываются в

одинаковых условиях
При больших сериях – стандартную пробу исследовать в начале серии и через каждые 20 проб
Расчет ведут по ствндарту или по фактору
Расчет по стандарту: Сi = Di х Cст/Dст
Расчет по фактору: С = D х F

Слайд 4

Методы определения без использования калибратора
Фотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора –

средние молекулы, серомукоид) – оптическую плотность умножают на 100
(D = 0,3, ответ – 30 единиц)

Слайд 5

Методы определения без использования калибратора
Определение концентрации по молярному показателю поглощения –

применение закона Бургера
С = D/lхξ (концентрация определяется делением измеренной оптической плотности на известный для данного вещества молярный показатель поглощения при длине волны измерения: С = D/ξ)
Учитывать разведение образца

Слайд 6

Спектральные характеристики хромогенов

Слайд 7

Примеры:
Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотности
Молярный показатель НАДН при

340 нм 6,22х10 3 лхмоль -1см-1. (ввести верхний символ). Измерена оптическая плотность в 1 см кювете – 0,38
Концентрация НАДН определяется по соотношению

Определение содержания гемоглобина гемоглобинцианидным методом
Милимолярный коэффициент при 540 нм = 11
Молекулярная масса гемоглобина – 64458, состоит из 4 суъединицю Эквивалентный вес Hb = 16114, т.е. 1 моль соответствует 16,114 Hb в крови
Кровь разводят трансформирующим раствором 1:251 (0,02 мл крови + 5,0 мл трансформирующего раствора)

Слайд 8

Измерение скорости изменения поглощения
Фотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакции
Потребление субстратов
Повышение

концентрации продуктов
Изменение кофакторов (оптический тест Варбурга)

Слайд 9

НАДН и НАДФН имееют максимум поглощения при λ 340 нм
НАДН и

НАДФН имееют максимум поглощения при λ 340 нм

Тест можно использовать для определения скорости тех реакций, которые протекают с образованием продуктов, которые окисляются с участием НАД или окислением НАДН

Слайд 10

Сопряженные реакции
Аланин + α-КГ → Пируват + Глутамат
Пируват + НАДН →

Лактат + НАД

ЛДГ

АЛТ

КК

КФ + АДФ → Креатин + АТФ
АТФ + глюкоза → АДФ + Гл-6-Ф
Гл-6-Ф + НАДН → 6-ФГ + НАД

гексокиназа

КК

Гл-6-ФДГ

Слайд 11

При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минуту
F
х
А – активность

фермента (МЕ, Ед или U)- кол-во молекул фермента, катализирующее превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин.
V – объем реакционной смеси
1000 – пересчет ммоль в мкмоль
ε– миллимолярный показатель поглощения НАДН (6,22 л/ммоль х см)
l – длина оптического пути (1 см)
v – объем пробы, мл
∆D – изменение оптической плотности за 1 мин

Vх1000

ε х l х v

Результат вычисления – фактор F

Слайд 12

Единицы активности ферментов
Катал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за

1 сек
МЕ - количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстата за 1минуту
МЕ/л↔0,0167 мккат/л или МЕ/л↔16,7 нкат/л

Слайд 13

Измерение по конечной точке
Реакция развивается за некоторый период времени и достигает

определенного конечного состояния (конечная точка)
При измерении по конечной точке уровень сигнала соответствует количеству продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации
Поглощение измеряется после окончания реакции при стабильном значении сигнала

Стрелки указаны моменты внесения буфере, реактива, биологической пробы

Слайд 14

1-точечное измерение на двухлучевом фотометре
Измерение ведется в режиме сравнения растворов в

двух кюветах
В каждую кювету вносится одинаковое количество реактива, в 1-ую – проба с известной концентрацией (стандартная), в другую – такое же кол-во воды (физ. р-ра) – бланк. Бланк автоматически вычитается

Сигнал развивается как функция времени для 6 стандартовИсходная точка - нуль. Концентрация каждого стандарта измеряется 1 раз по конечной точке (по достижении стационарного уровня

Слайд 15

Измерение с бланком на однолучевом фотометре
Для исключения систематического влияния (рабочий реактив,

отражение от стенок кювет, темновой ток) используют измерение относительно холостой пробы (бланка)
Бланк определяют по рабочему реактиву перед измерением пробы
Dпробы = Dконечной точки – Dбланка
Процедура сходна с одноточечным измерением, но учет бланка проводится в ручном режиме

Слайд 16

Рабочая таблица для определения концентрации методом измерения с бланком по рабочему

реактиву

Слайд 17

Измерение с прозоной
Разновидность измерения с бланком
Измерение в одной кювете, отсутствует кювета

сравнения
Проводят определение до прибавления биопробы
Характерен для биохимических анализаторов (двухточечное измерение с прозоной)
Прозона – временной период до добавления в кювету пробы.
При добавлении нескольких реактивов прозона определяется при достижении стабильного состояния после внесения всех реактивов перед пробой

Слайд 18

Двухволновое измерение с опорной длиной волны
Необходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз,

иктеричность, липемичность, использование исчерченных кювет)
Измерение проводят на 2 длинах волн – основной и поддерживающей
Измеряется только сигнал, связанный с аналитом
Может применяться на приборах, у которых кювета облучается белым светом, а монохроматор расположен после кюветы
Опорная волна не должна отступать от основной более, чем на 100 нм

Поглощение, соответствующее влиянию интерферирующих факторов (поглощение на соседних длинах волн) отсекается. Учитывается только плотность выше Dопорная

Слайд 19

Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки
20 мкл

сыворотки, смешать с 200 мкл дистиллированной воды, добавить 600 мкл 0,15 М фосфатный буфер (рН = 7,4)
Раствор измеряется при длинах волн 460, 500, 576, 597, и 750 нм Вычисляются
∆D 460/500 (разность плотностей) (иктеричность)
∆D 576/597 (разность плотностей) (гемолитичность)
∆D 597/750 (разность плотностей) (липемичность)

Слайд 20

Слайд 21

Кинетические измерения
Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности
Широко используется для

определения активности ферментов
Требует точного поддержания температуры в измерительной кювете (+ 0,1º С), правильного отсчета временных интервалов
Условия обязательны, доступны только при использовании современных фотометров и биохимических анализаторов

Слайд 22

Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментов
Коэффициенты имееют ориентировочный характер, т.к. зависят

также от буфера, рН, ионной силы т.д.

Слайд 23

Измерение по кинетике
А - скорость постоянна, в любой период можно

по скорости реакции оценивать активность фермента, Б - скорость реакции постоянно снижается, рекомендуется активность фермента оценивать по начальной скорости, В - линейный участок, на котором рекомендуется определять активность фермента, устанавливается в середине периода инкубации

Слайд 24

Измерение по двум точкам
При постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить

на любом отрезкелинейной кривой, приводя поглощение к 1 мин.
Достоинства – простота, возможность измерения без стандарта, независимость в пределах линейного диапазона.
Допустим при повторном использовании разовых кювет
Следует убедиться что измерение проводится в линейном диапазоне

Слайд 25

Измерение по двум точкам
Возможны методические ошибки
Если реакция начинается с очень высокой

скоростью, то она может замедлиться или прекратиться из-за потребления всего субстрата.
Несоответствие выяляется при сопоставлении клинических данных и биохимических исследований
Реакция может иметь нелинейный характер

Слайд 26

Измерение по двум точкам
Реакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных

системах)
Обусловлена, по-видимому, задержкой образованием фермент-субстратного комплекса.
Может продолжаться до нескольких минут
Имеет значение порядок внесения реактивов – для лучшего перемешивания реактив большего объема добавлять к меньшему объему.
В измерительную кювету вносится сначала проба, а затем рабочий реактив.

Слайд 27

Многоточечное измерение
Позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок
Является

наиболее точным методом определения активности ферментов
Изменение оптического поглощения должно быть одинаковым за равные промежутки времени (отклонение от линейности не должно превышать 10%)

Слайд 28

Многоточечное измерение
Измерение по начальной скорости
Скорость увеличивается в зависимости от количества фермента

при одинаковой начальной концентрации субстрата
Возникает в случае малого количества фермента
Плато достигается, но время его достижения может быть большим.
Регистрацию ведут на нелинейном участке

Кинетические кривые при разной низкой концентрации фермента и постоянной начальной концентрации субстрата. Начальная скорость удваивается при удвоении количества фермента, но кинетика нелинейна

Слайд 29

Измерение по начальной скорости
Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент

времени светопропускания. Показатель, соответствующий максиальной скорости – значение максимальной скорости измененияоптического поглощения.
Доступен только автоматическим анализаторам

Слайд 30

Многоточечное измерение
Кинетический метод с коррекцией по бланку образца
Используется для определения активности

ферментов и количественного измерения концентрации субстратов
Одновременно может меняться бланк рабочего реактива

Кинетическое измерение с коррекцией по образцу бланка. Используется при нестабильном бланке. Возможные моменты измерения пробы указаны стрелками

Слайд 31

Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения

реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора)
При постановке на обычном фотометре необходимо знать диагноз. Избыток антигена наблюдается в чрезвычайной ситуации. При миеломной болезни концентрация IgG может быть очень высокой, и исследование попадает в зону избытка антигена. Необходимо электрофоретическое исследование
В качестве стандартов и контрольных материалов необходимо использовать стандарты и сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых измерена с использованием иммунохимической реакции

Слайд 32

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Схема однолучевого метода измерения оптической плотности

исследуемого раствора относительно раствора сравнения в одной и той же спектральной полосе излучения. Последовательно измеряется оптическая плотность кюветы со стандартом и исследуемой пробой

Однолучевое фотометрирование

Слайд 33

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Двухлучевое фотометрирование
Оптическая плотность исследуемого и сравнительного

образцов измеряется одновременно на двух каналах. Сигналы поступают на 2 фотоприемника и представляются на 2-х индикаторах. Устраняется временная нестабильность источника излучения. Недостаток – наличие двух фотоприемников

Слайд 34

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Двухлучевое фотометрирование
Оптическая плотность исследуемого и сравнительного

образцов измеряется одновременно на двух каналах, сигналы поступают на 2 фотоприемника и на устройство сравнения. Устройство сравнения может быть нуль-индикатором, в этом случае одной из щелей добиваются выравнивания сигнала в 2-х каналах или на индикатор может выводиться искомая величина

Слайд 35

Двухлучевое фотометрирование
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Разделение 2-х лучей во времени

с одним монохроматором, одним фотоприемником и анализатором.
Два луча от монохроматора приходят на вращающийся диск с зеркальными и прозрачными секциями (переключатель лучей). Короткие импульсы 2-х лучей, разделенные во времени, поступают на один фотоприемник. Импульсные сигналы сравниваются анализатором и на индикатор поступает искомая величина. Устраняется временная нестабильность источника излучения и фотоприемника. Наиболее точная схема измерения

Слайд 36

Волоконный световод минимизирует оптическую схему

Слайд 37

Основные элементы биохимического анализатора

Слайд 38

Двухлучевое фотометрирование
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Разделение 2-х лучей во времени

Слайд 39

Рассеяние света
Мутный раствор в кювете
- поглощает свет (если окрашен)
- частично

проходит, не изменяя направления (трансмиссия)
- частично рассеивается, изменяя направление под различными углами (рассеивание)

Слайд 40

Рассеяние света
Трансмиссия и рассеивание зависят от
- длины волны светового потока
- частоты

светового потока
- интенсивности светового потока
- свойств рассеивающей среды (размера и формы частиц, количества, способности к поляризации и др)
Если в процессе измерения размер частиц в растворе меняется, будет меняться поток проходящего и рассеивающего света

Слайд 41

Определение светорассеивания
Зависит от
длины волны (λ)
Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание
Если

размер частиц значительно меньше длины волны светового потока (<λ/10) – упругое рассеяние

Слайд 42

Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея
Ir и I0 –

интенсивность рассеянного и падающего света, n1 и n – коэффициенты преломления частиц и среды, N – общее число частиц, V – объем частиц, λ – длина волны падающего света, d – расстояние до наблюдателя, β – угол, образованный падающим и рассеянным светом

При лабораторных исследованиях величины V, n1, n, λ, d и β – известны и постоянны для исследуемого вещества, N = С*b. С – концентрация вещества, b – толщина раствора.
Для определенного угла формула принимает вид
Известные параметры объединены в коэффициент k

Слайд 43

В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции
Рассеяние света каждой частицей

не зависит друг от друга.
Рассеянный свет распространяется во всех направлениях
Максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180º
При λ 400нм – такой тип рассеивания характерен для частиц диаметром < 40 нм (иммуноглобулины,β- липопротеины, альбумин)

Слайд 44

При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным
Максимальное количество света рассеивается

в направлении падающего луча
При λ 400нм (Ig M, хиломикроны, формирующиеся комплексы антигенов с иммуноглобулинами)

Слайд 45

При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается
Характерен

для взвеси бактерий, клеток крови (тромбоциты, эритроциты)

Слайд 46

Нефелометрия
Измерение рассеянного света
Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию

вещества в растворе

А – нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеяние
Б- нефелометр, регистрирующий рассеяние под углом 90º

Слайд 47

Оптическая схема нефелометра
1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная

пластинка, разделяющая свет на 2 пучка; 4 – кювета с исследуемым раствором; 5 – ловушка света; 7, 8, 9 – линзы; 8 – уравнительные диафрагмы; 10 – ромбические призмы; 12 - окуляр

Свет разделяется на 2 пучка – один проходит черезраствор исследуемого вещества, другой – через канал сравнения
Источник света – лампы или лазерные источники излучения (высокая интенсивность излучения, строгая направленность, строгая фиксированная длина волны – идеален для нефелометрии)

Слайд 48

Турбидиметрия
Измерение прошедшего света
Турбидиметры построены по типу фотометров
Интенсивность прошедшего светового потока определяется

уравнением

I0 – интенсивность падающего света
It – интенсивность потока, прошедшего через раствор
С – концентрация рассеивающих частиц
B – толщина поглощающего слоя
d – средний диаметр рассеивающих частиц
k и α – константы, зависящие от природы вещества и метода измерения
λ- длина волны

Слайд 49

Турбидиметрия
Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов
t – молярный коэффициент мутности

раствора (турбидность)
В качестве турбидиметров можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов
Обычно используются короткие волны (340 нм), т.к. доля рассеянного света увеличивается обратно пропорционально четвертой степени длины волны – т.е. при меньшей длине волны прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, для более короткого ультрафиолета нужна специальная оптика

При постоянных b, d, k, α и λ получим

Слайд 50

Турбидиметрия и нефелометрия
Используются для определения индивидуальных белков
Особенность – построение калибровочного графика

с использованием не менее пяти концентраций (калибровочный график имеет нелинейный характер)

Слайд 51

Кривая доза-эффект
При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты
При постоянной концентрации антител при невысокой

концентрации антигена все антигена связываются с антителами. При осаждении комплексов центрифугированием – в супернатанте – несвязанные антитела – избыток антител. Преципитат не образуется

Слайд 52

При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок –

преципитат. В супернатанте не определяются антитела и антигены – эквивалентное состояние

Кривая доза-эффект

Слайд 53

При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка.

Частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат не формируется. В супернатанте – свободные антигены – антиген-эксцесс

Кривая доза-эффект

Слайд 54

Кривая доза-эффект
Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля
Зона избытка антител – величина преципитатов

увеличивается по мере добавления антигенов. В супернатанте свободные антитела
Зона соответствия антигена и антитела –максимальная препитация. В супернатанте нет свободных антител и антигенов
Зона избытка антигенов. Формирование небольших иммунных комплексов, а не преципитат. В супернатанте – свободные антигены

Слайд 55

Калибровочный график
Строится для
-каждого индивидуального белка
-каждого прибора
-при любом условий регистрации
-периодически при проведении

исследований
При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании измерения одного из стандартов. (вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, происходит параллельный сдвиг всего графика)

Для построения графика требуется по крайней мере 5 стандартных растворов

Слайд 56

1- если после добавления антигена реакция ускоряется, имеет место избыток антител

(измерение проводится правильно)

Состав реакционной смеси подбирается так, чтобы измерение производилось в зоне избытка антител.
При очень высокой концентрации белка антител недостаточно, частицы преципитата становятся мелкими (нисходящая часть кривой) – с увеличением концентрации белка сигнал прибора уменьшается. Может быть выдан неправильный результат.
Проводят разведение биологической жидкости
Если сигнал увеличивается – определение проводилось в нисходящей части кривой
Разведение проводят до степени избытка антител

1- если после добавления антигена реакция ускоряется, имеет место избыток антител (измерение проводится правильно)

2- если после добавления антигена реакция не ускоряется, имеет место избыток антигена (измерение проводится неверно)

Слайд 57

Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения

Слайд 58

Спасибо за внимание

Слайд 59

КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР

Слайд 60

Спектрофотометр без монохроматора

Слайд 61

Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой

Слайд 62

Слайд 63

Спектр поглощения производных гемоглобина
спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина

(HbH); 2 – карбоксигемоглобина (HbCO) 3 – оксигемоглобина (HbO2); 4 – метгемоглобина (MetHb).

Фотометрические методы биохимического анализа

Содержание

ИЗМЕРЕНИЕ ПО КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ

Методы сравнения стандартного и опытного образцаАнализируемая и стандартная проба обрабатываются в

Методы определения без использования калибратораФотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора –

Методы определения без использования калибратораОпределение концентрации по молярному показателю поглощения –

Спектральные характеристики хромогенов

Примеры:Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотностиМолярный показатель НАДН при

Измерение скорости изменения поглощенияФотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакцииПотребление субстратовПовышение

НАДН и НАДФН имееют максимум поглощения при λ 340 нмНАДН и

Сопряженные реакцииАланин + α-КГ → Пируват + ГлутаматПируват + НАДН →

При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минутуFхА – активность

Единицы активности ферментовКатал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за

Измерение по конечной точкеРеакция развивается за некоторый период времени и достигает

1-точечное измерение на двухлучевом фотометреИзмерение ведется в режиме сравнения растворов в

Измерение с бланком на однолучевом фотометреДля исключения систематического влияния (рабочий реактив,

Рабочая таблица для определения концентрации методом измерения с бланком по рабочему

Измерение с прозонойРазновидность измерения с бланкомИзмерение в одной кювете, отсутствует кювета

Двухволновое измерение с опорной длиной волныНеобходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз,

Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки20 мкл

Кинетические измерения Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотностиШироко используется для

Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментовКоэффициенты имееют ориентировочный характер, т.к. зависят

Измерение по кинетике А - скорость постоянна, в любой период можно

Измерение по двум точкамПри постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить

Измерение по двум точкамВозможны методические ошибкиЕсли реакция начинается с очень высокой

Измерение по двум точкамРеакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных

Многоточечное измерениеПозволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участокЯвляется

Многоточечное измерениеИзмерение по начальной скоростиСкорость увеличивается в зависимости от количества фермента

Измерение по начальной скорости Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент

Многоточечное измерениеКинетический метод с коррекцией по бланку образцаИспользуется для определения активности

Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворовСхема однолучевого метода измерения оптической плотности

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворовДвухлучевое фотометрированиеОптическая плотность исследуемого и сравнительного

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворовДвухлучевое фотометрированиеОптическая плотность исследуемого и сравнительного

Двухлучевое фотометрированиеФотометрические схемы измерения оптического поглощения растворовРазделение 2-х лучей во времени

Волоконный световод минимизирует оптическую схему

Основные элементы биохимического анализатора

Двухлучевое фотометрированиеФотометрические схемы измерения оптического поглощения растворовРазделение 2-х лучей во времени

Рассеяние светаМутный раствор в кювете - поглощает свет (если окрашен)- частично

Рассеяние светаТрансмиссия и рассеивание зависят от- длины волны светового потока- частоты

Определение светорассеиванияЗависит от длины волны (λ)Диаметра частиц, на которых происходит рассеиваниеЕсли

Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению РелеяIr и I0 –

В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракцииРассеяние света каждой частицей

При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричнымМаксимальное количество света рассеивается

При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличиваетсяХарактерен

НефелометрияИзмерение рассеянного светаСравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию

Оптическая схема нефелометра1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная

ТурбидиметрияИзмерение прошедшего светаТурбидиметры построены по типу фотометровИнтенсивность прошедшего светового потока определяется

ТурбидиметрияВыражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворовt – молярный коэффициент мутности

Турбидиметрия и нефелометрияИспользуются для определения индивидуальных белковОсобенность – построение калибровочного графика

Кривая доза-эффектПри взаимодействии антиген-антитело образуют агрегатыПри постоянной концентрации антител при невысокой

При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок –

При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка.

Кривая доза-эффектКлассическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля Зона избытка антител – величина преципитатов

Калибровочный графикСтроится для-каждого индивидуального белка-каждого прибора-при любом условий регистрации-периодически при проведении

1- если после добавления антигена реакция ускоряется, имеет место избыток антител

Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения

Спасибо за внимание

КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР

Спектрофотометр без монохроматора

Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой

Спектр поглощения производных гемоглобина спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина

Похожие презентации

Методы сравнения стандартного и опытного образца
Анализируемая и стандартная проба обрабатываются в

Методы определения без использования калибратора
Фотометрические единицы (в случае отсутствия калибратора –

Методы определения без использования калибратора
Определение концентрации по молярному показателю поглощения –

Примеры:
Определение концентрации НАДН на основе определения оптической плотности
Молярный показатель НАДН при

Измерение скорости изменения поглощения
Фотометрические измерения проводят непосредственно при протекании реакции
Потребление субстратов
Повышение

НАДН и НАДФН имееют максимум поглощения при λ 340 нм
НАДН и

Сопряженные реакции
Аланин + α-КГ → Пируват + Глутамат
Пируват + НАДН →

При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 минуту
F
х
А – активность

Единицы активности ферментов
Катал – количество фермента, превращающего 1 моль субстата за

Измерение по конечной точке
Реакция развивается за некоторый период времени и достигает

1-точечное измерение на двухлучевом фотометре
Измерение ведется в режиме сравнения растворов в

Измерение с бланком на однолучевом фотометре
Для исключения систематического влияния (рабочий реактив,

Измерение с прозоной
Разновидность измерения с бланком
Измерение в одной кювете, отсутствует кювета

Двухволновое измерение с опорной длиной волны
Необходимо для исключения мешающих факторов (гемолиз,

Принцип получения информации о степени иктеричности, липемичности и гемолиза сывортки
20 мкл

Кинетические измерения
Определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности
Широко используется для

Корректирующие температурные коэффициенты для активности ферментов
Коэффициенты имееют ориентировочный характер, т.к. зависят

Измерение по кинетике
А - скорость постоянна, в любой период можно

Измерение по двум точкам
При постоянной скорости кинетической реакции измерение можно проводить

Измерение по двум точкам
Возможны методические ошибки
Если реакция начинается с очень высокой

Измерение по двум точкам
Реакция может задержаться на старте (Lag-фаза в мультиферментных

Многоточечное измерение
Позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок
Является

Многоточечное измерение
Измерение по начальной скорости
Скорость увеличивается в зависимости от количества фермента

Измерение по начальной скорости
Измерение скорости реакции. Регистрируется изменение в каждый момент

Многоточечное измерение
Кинетический метод с коррекцией по бланку образца
Используется для определения активности

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Схема однолучевого метода измерения оптической плотности

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Двухлучевое фотометрирование
Оптическая плотность исследуемого и сравнительного

Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Двухлучевое фотометрирование
Оптическая плотность исследуемого и сравнительного

Двухлучевое фотометрирование
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Разделение 2-х лучей во времени

Двухлучевое фотометрирование
Фотометрические схемы измерения оптического поглощения растворов
Разделение 2-х лучей во времени

Рассеяние света
Мутный раствор в кювете
- поглощает свет (если окрашен)
- частично

Рассеяние света
Трансмиссия и рассеивание зависят от
- длины волны светового потока
- частоты

Определение светорассеивания
Зависит от
длины волны (λ)
Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание
Если

Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея
Ir и I0 –

В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции
Рассеяние света каждой частицей

При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным
Максимальное количество света рассеивается

При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается
Характерен

Нефелометрия
Измерение рассеянного света
Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию

Оптическая схема нефелометра
1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная

Турбидиметрия
Измерение прошедшего света
Турбидиметры построены по типу фотометров
Интенсивность прошедшего светового потока определяется

Турбидиметрия
Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов
t – молярный коэффициент мутности

Турбидиметрия и нефелометрия
Используются для определения индивидуальных белков
Особенность – построение калибровочного графика

Кривая доза-эффект
При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты
При постоянной концентрации антител при невысокой

Кривая доза-эффект
Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля
Зона избытка антител – величина преципитатов

Калибровочный график
Строится для
-каждого индивидуального белка
-каждого прибора
-при любом условий регистрации
-периодически при проведении

Спектр поглощения производных гемоглобина
спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина