Производство моноклональных антител

Июль 24, 2022

Главная
Медицина
Производство моноклональных антител

Содержание

2. ПЛАН ЛЕКЦИИ: Text in here 2. Моноклональные антитела (МкАТ). История создания МкАТ. 1. Иммуноферментный анализ (ИФА)
3. Иммунная система – это система органов и клеток, реагирующая на генетически чужеродную информацию и участвующая в
4. Иммунопрофилактика – комплекс противоэпидемических мероприятий, направленный на предупреждение инфекционных болезней и осуществляемый путем иммунизации.
5. Иммуноферментный анализ (ИФА) - это лабораторное исследование, основанное на реакции «антиген-антитело». Суть этого лабораторного метода -
6. Материалом для проведения иммуноферментного анализа является кровь, взятая из вены. Помимо крови для ИФА могут понадобиться
7. В качестве «маркеров» применяются 1. радиоактивные метки (это радиоиммунный анализ (РИА, с использованием радиоактивных атомов –
8. Принцип проведения иммуноферментного анализа крови Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA) Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х
9. Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA) Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой
10. Расшифровка результатов анализа Иммуноферментный анализ крови позволяет выявить антитела разных видов. Это иммуноглобулины класса А, М,
11. Преимущества иммуноферментного анализа высокая чувствительность и точность метода; возможность проведения ранней диагностики, поскольку ИФА позволяет определять
12. Моноклональные антитела (МкАТ) — это антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть
13. МкАТ – химически гомогенные по структуре антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа, синтезируемые клонированными гибридомами
14. Эпитоп – фрагмент молекулы антигена, локализующийся внутри или на поверхности молекулы, определяющий его специфичность.
15. Гибридома (клетка гибридная) – гибридная клеточная линия, полученная при слиянии нормальных антителообразующих клеток и миеломных клеток.
16. В 1895 г. осуществлена первая попытка применения антител для лечения онкологических заболеваний. В 1975 г. лауреты
17. Этапы получения гибридом Селекция миеломных клеток. Иммунизация мышей антигеном. Получение В-лимфоцитов. Гибридизация клеток миеломы и В-лимфоцитов.
18. 7. Накопление клона гибридом, синтезирующих моноклональные антитела заданной специфичности (к известному антигену). 8. Крупномасштабное культивирование гибридом
20. 1. Селекция миеломных клеток В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс. Клетки миеломы (плазмоциты)
21. Клетки плазмоцитомы для гибридизации получают путем мутагенеза. Должны обладать устойчивостью к токсичным аналогам азотистых оснований, входящих
22. 2. Иммунизация мышей антигеном Иммунизация стимулирует формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование. Антиген вводят в/в, в/б,
23. 3. Получение клеток селезенки Лимфоидная ткань селезенки мыши способствует накоплению плазматических клеток, синтезирующих антитела. Через 4
24. 4. Гибридизация клеток миеломы и В-лимфоцитов. Лимфоциты селезенки и клетки миеломы смешивают, осаждают центрифугированием, готовят суспензию,
25. 5. Селекция гибридом на среде ГАТ Осадок клеток ресуспендируют в среде ГАТ, содержащей: гипоксантин (Г), аминоптерин
26. Каждые 4 дня проводят замену среды в лунках.
27. Аминофолиевая кислота оказывает цитостатическое действие, ингибирует биосинтез пуринов, тимина и др. аминокислот. Гипоксантин и тимидин добавляют
28. 1. Неслившиеся лимфоциты отмирают после гибридизации, т.к. не способны выживать in vitro. 2. Выживают непрерывно растущие
29. 6. Определение антителообразующей способности гибридом Идентификацию клеток, синтезирующих антитела, проводят с помощью гибридомной технологии. Наличие антител
30. 7. Клонирование гибридом Гибридомы клонируют методом предельных разведений. Клетки ресуспендируют в среде с добавлением сыворотки крови
31. 8. Накопление клеток, синтезирующих МкАТ Гибридомы легко культивируются в замороженном состоянии в жидком азоте при -700С
32. 9. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление МкАТ: Способы: 1. Инкубирование в аппаратах эрлифтного типа (суспензия клеток-антителопродуцентов
33. 3. Мембранно-перфузионный способ (фирма «Millipor»). Гибридомы достаточно стабильны и выход МкАТ высокий.
34. 10. Очистка. Современные способы разделения: 1. Центрифугирование; 2. Мембранная фильтрация и др.
35. В терапии опухолей используют два типа МкАТ: простые — МкАТ, не связанные ни с какими цитотоксическими
36. Ритуксимаб (Ритуксан (США), Мабтера (Россия)) - первым МкАТ, применяемый в онкологии. Ритуксимаб — это химерное МкАТ
37. Кэмпас используется для уменьшения реакции «трансплантат против хозяина».
38. Трастузумаб (Герцептин (Россия)) - первый гуманизированный антителом, зарегистрированным для лечения солидных опухолей - собирательное обозначение опухолей,
39. Бевацизумаб (Авастин (Россия)) - рекомбинантный гуманизированный МкАТ, способен угнетать рост опухоли, обладает цитостатическим и цитотоксическим эффектом.
40. МкАТ как носители активных веществ МкАТ применяют для доставки цитотоксических веществ к опухолевым клеткам. Преимущества: 1.
41. Современные конъюгированные МкАТ подразделяют на следующие группы: с радиоактивными частицами (радиоиммунотерапии); с цитостатиками; с токсинами (или
42. Зевалин — МкАТ против CD20, соединенное с иттрием-90. Обеспечивает более высокую эффективность по сравнению с терапией
43. Тозитумомаб (Бексар) — мышиные МкАТ к антигену CD20, к которым прикреплен радиоактивный изотоп йода-131. Препарат получил
44. Иммунотоксины получают присоединением к МкАТ бактериальных (дифтерийного токсина, экзотоксина синегнойной палочки) или растительных токсинов (рицина А
46. Скачать презентацию

Слайд 2

ПЛАН ЛЕКЦИИ:
Text in here
2. Моноклональные антитела (МкАТ).
История создания МкАТ.
1. Иммуноферментный

анализ (ИФА)

3. Этапы производства МкАТ.

4. Современная номенклатура МкАТ.

Слайд 3

Иммунная система –
это система органов и клеток, реагирующая на генетически

чужеродную информацию и участвующая в защите макроорганизма от такой информации.
Состоит из 3 компонентов:
Клеточный;
Молекулярный;
Генетический.

Слайд 4

Иммунопрофилактика –
комплекс противоэпидемических мероприятий, направленный на предупреждение инфекционных болезней и

осуществляемый путем иммунизации.

Слайд 5

Иммуноферментный анализ (ИФА) - это лабораторное исследование, основанное на реакции «антиген-антитело». Суть

этого лабораторного метода - выявление специфических антител с помощью специальных биохимических реакций, которые помогают определить присутствие или отсутствие антител и их количество.
Методом ИФА можно определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других БАВ

Слайд 6

Материалом для проведения иммуноферментного анализа является кровь, взятая из вены. Помимо

крови для ИФА могут понадобиться околоплодные воды и материал стекловидного тела.

Слайд 7

В качестве «маркеров» применяются
1. радиоактивные метки (это радиоиммунный анализ (РИА, с

использованием радиоактивных атомов – тритий, радиоактивный иод и другие).
2. ферментные метки (если ферменты стабильны, активны и действуют в минимальных концентрациях). Суть: субстрат превращается в продукт и далее обнаруживается фотометрическим методом.
3. Субстратные метки (АТФ и НАД), которые «пришиваются» к молекуле антигена через адениновый остаток и сохраняют способность взаимодействия с ферментом.
Для введения ферментативной метки применяются химические, биохимические, иммунологические способы.

Слайд 8

Принцип проведения иммуноферментного анализа крови
Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)
Метод непрямого иммуноанализа

характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

Слайд 9

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)
Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия

по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.
Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)
В данном варианте иммуноанализа используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

Слайд 10

Расшифровка результатов анализа
Иммуноферментный анализ крови позволяет выявить антитела разных видов.
Это

иммуноглобулины класса А, М, G.

Слайд 11

Преимущества иммуноферментного анализа
высокая чувствительность и точность метода;
возможность проведения ранней диагностики, поскольку

ИФА позволяет определять классы иммуноглобулинов при анализе;
прослеживание динамики инфекционного процесса;
возможность получения быстрого ответа;
удобство метода.
Недостатки
Основным недостатком иммуноферментного анализа является тот факт, что в редких случаях метод выдает ложноотрицательные или ложноположительные результаты.

Слайд 12

Моноклональные антитела (МкАТ) — это антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к

одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы.
МкАТ могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки МкАТ могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать.
МкАТ широко используются в биохимии МкАТ широко используются в биохимии, молекулярной биологии МкАТ широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине.

Слайд 13

МкАТ – химически гомогенные по структуре антитела, строго специфичные в отношении

одного эпитопа, синтезируемые клонированными гибридомами – клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломными опухолевыми клетками, способными к неорганическому росту.

Слайд 14

Эпитоп – фрагмент молекулы антигена, локализующийся внутри или на поверхности молекулы,

определяющий его специфичность.

Слайд 15

Гибридома (клетка гибридная) – гибридная клеточная линия, полученная при слиянии нормальных

антителообразующих клеток и миеломных клеток.

Слайд 16

В 1895 г. осуществлена первая попытка применения антител для лечения онкологических

заболеваний.
В 1975 г. лауреты Нобелевской премии Жорж Келер и Сезар Мильштейн впервые предложили процесс получения МкАТ.
В 1988 г. Грег Винтер разработал специальную методику «очеловечивания» моноклональных антител.

Слайд 17

Этапы получения гибридом
Селекция миеломных клеток.
Иммунизация мышей антигеном.
Получение В-лимфоцитов.
Гибридизация клеток миеломы и

В-лимфоцитов.
Селекция гибридом на среде ГАТ.
Определение антителообразующей способности гибридом.

Слайд 18

7. Накопление клона гибридом, синтезирующих моноклональные антитела заданной специфичности (к известному

антигену).
8. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление моноклональных антител.
9. Концентрирование, выделение и очистка МкАТ.

Слайд 19

Слайд 20

1. Селекция миеломных клеток
В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и

крыс.
Клетки миеломы (плазмоциты) - это злокачественно трансформированные лимфоидные клетки костного мозга.
Клетки миеломы - клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, синтезируемые МкАТ неизвестной специфичности и обладающие способностью к неограниченному размножению.

Слайд 21

Клетки плазмоцитомы для гибридизации получают путем мутагенеза. Должны обладать устойчивостью

к токсичным аналогам азотистых оснований, входящих в состав ДНК.

Слайд 22

2. Иммунизация мышей антигеном
Иммунизация стимулирует формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование.
Антиген

вводят в/в, в/б, п/к с адъювантом (в-вом, усиливающим иммуногенность антигенов) или без него в нарастающей дозе.

Слайд 23

3. Получение клеток селезенки
Лимфоидная ткань селезенки мыши способствует накоплению плазматических клеток,

синтезирующих антитела.
Через 4 дня после инъекции антигена мышей убивают, селезенку извлекают, измельчают и готовят суспензию, содержащую аминокислоты, витамины, углеводы, неорганические соли.

Слайд 24

4. Гибридизация клеток миеломы и В-лимфоцитов.
Лимфоциты селезенки и клетки миеломы смешивают,

осаждают центрифугированием, готовят суспензию, выдерживают 30-40 минут при 370С, повторно центрифугируют.
Для слияния клеток добавляют к среде ПЭГ и CaCl2 , обеспечивающие перераспределение мембранных белков, обеспечивая контакт и слияние клеток.

Слайд 25

5. Селекция гибридом на среде ГАТ
Осадок клеток ресуспендируют в среде ГАТ,

содержащей:
гипоксантин (Г),
аминоптерин (А),
тимидин (Т),
разливают в лунки микропланшет и инкубируют при 370С в атмосфере СО2 в течение 10-16 дней.

Слайд 26

Каждые 4 дня проводят замену среды в лунках.

Слайд 27

Аминофолиевая кислота оказывает цитостатическое действие, ингибирует биосинтез пуринов, тимина и др.

аминокислот.
Гипоксантин и тимидин добавляют в среду в качестве предшественников пуринов и пиримидинов.

Слайд 28

1. Неслившиеся лимфоциты отмирают после гибридизации, т.к. не способны выживать in

vitro.
2. Выживают непрерывно растущие клоны гибридных клеток.
3. Подсчет количества клонов в лунках проводят с помощью микроскопа.

Слайд 29

6. Определение антителообразующей способности гибридом Идентификацию клеток, синтезирующих антитела, проводят с помощью

гибридомной технологии. Наличие антител определяют в надосадочных фракциях культуральной среды в лунках микропланшет. Отбирают 50 мкл среды. Определение антител проводят методом радиоиммуноанализа (РИА) или иммуноферментного анализа (ИФА)

Слайд 30

7. Клонирование гибридом
Гибридомы клонируют методом предельных разведений.
Клетки ресуспендируют в среде

с добавлением сыворотки крови плода коровы и затем разводят этой же средой.
В каждую лунку должна попасть клетка, содержащая 1 клон гибридом.

Слайд 31

8. Накопление клеток,
синтезирующих МкАТ
Гибридомы легко культивируются в замороженном состоянии в

жидком азоте при -700С в среде, содержащей сыворотку крови и 1% диметилсульфоксид.

Слайд 32

9. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление МкАТ: Способы: 1. Инкубирование в аппаратах эрлифтного

типа (суспензия клеток-антителопродуцентов перемешивается путем подачи СО2 и воздуха). 2. Совмещение эрлифтного культивирования с микрокапсулированием (гибридомы иммобилизуют на стеклянном матриксе, в капсулах агарозы; цикл культивирования – 1 месяц., выход антител – 59-250 мг/мл).

Слайд 33

3. Мембранно-перфузионный способ
(фирма «Millipor»). Гибридомы достаточно стабильны и выход МкАТ

высокий.

Слайд 34

10. Очистка. Современные способы разделения: 1. Центрифугирование; 2. Мембранная фильтрация и др.

Слайд 35

В терапии опухолей используют два типа МкАТ:
простые — МкАТ, не

связанные ни с какими цитотоксическими веществами;
конъюгированные — МкАТ, лечебный эффект которых обусловлен присоединенными к антителу веществами (радиоактивными частицами, цитостатиками или токсинами).

Слайд 36

Ритуксимаб (Ритуксан (США), Мабтера (Россия)) - первым МкАТ, применяемый в онкологии.

Ритуксимаб — это химерное МкАТ (мышиный и человеческий МкАТ).
Алемтузумаб (Мабкэмпас, Кэмпас (Россия)) — гуманизированное МкАТ к антигену CD52. Предназначен для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) у взрослых.

Слайд 37

Кэмпас используется для уменьшения реакции «трансплантат против хозяина».

Слайд 38

Трастузумаб (Герцептин (Россия)) - первый гуманизированный антителом, зарегистрированным для лечения солидных

опухолей - собирательное обозначение опухолей, которые имеют определенную локализацию - место расположения, и этим отличаются от другой группы - опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной ткани - лейкозов.
Трастузумаб — рекомбинантные гуманизированные МкАТ против HER2/neu-рецепторов, принадлежащих к рецепторам эпидермального фактора роста.

Слайд 39

Бевацизумаб (Авастин (Россия)) - рекомбинантный гуманизированный МкАТ, способен угнетать рост опухоли,

обладает цитостатическим и цитотоксическим эффектом.
Цетуксимаб (Эрбитукс (Россия)) — химерное МкАТ, блокирующее активацию рецептора эпидермального фактора роста. Применяют для лечения рака толстой кишки,опухолей головы и шеи.

Слайд 40

МкАТ как носители активных веществ
МкАТ применяют для доставки цитотоксических веществ к

опухолевым клеткам.
Преимущества:
1. Позволяет избежать повреждения здоровых тканей;
2. Усиливает противоопухолевый эффект цитостатиков.
3. Способствует проникновению глубоко в ткани опухоли антител.

Слайд 41

Современные конъюгированные МкАТ подразделяют на следующие группы:
с радиоактивными частицами (радиоиммунотерапии);

с цитостатиками;
с токсинами (или иммунотоксинами).
Зарегистрировано два МкАТ, соединенных с радиоактивными частицами.

Слайд 42

Зевалин — МкАТ против CD20, соединенное с иттрием-90.
Обеспечивает более

высокую эффективность по сравнению с терапией простым антителом к CD20.

Слайд 43

Тозитумомаб (Бексар) — мышиные МкАТ к антигену CD20, к которым прикреплен

радиоактивный изотоп йода-131. Препарат получил одобрение для лечения рецидивов фолликулярных лимфом.

Слайд 44

Иммунотоксины получают присоединением к МкАТ бактериальных (дифтерийного токсина, экзотоксина синегнойной палочки)

или растительных токсинов (рицина А или сапорина).
Милотарг – иммунотоксин, применяемый в терапии острого миелобластного лейкоза у пожилых. Милотарг представляет собой человеческие антитела к антигену CD33.

Производство моноклональных антител

Содержание

ПЛАН ЛЕКЦИИ:Text in here2. Моноклональные антитела (МкАТ). История создания МкАТ.1. Иммуноферментный

Иммунная система – это система органов и клеток, реагирующая на генетически

Иммунопрофилактика – комплекс противоэпидемических мероприятий, направленный на предупреждение инфекционных болезней и

Иммуноферментный анализ (ИФА) - это лабораторное исследование, основанное на реакции «антиген-антитело». Суть

Материалом для проведения иммуноферментного анализа является кровь, взятая из вены. Помимо

В качестве «маркеров» применяются1. радиоактивные метки (это радиоиммунный анализ (РИА, с

Принцип проведения иммуноферментного анализа кровиНепрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)Метод непрямого иммуноанализа

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия

Расшифровка результатов анализаИммуноферментный анализ крови позволяет выявить антитела разных видов. Это

Преимущества иммуноферментного анализавысокая чувствительность и точность метода;возможность проведения ранней диагностики, поскольку