Как заглянуть в митохондрию с помощью наночастиц

Содержание

Слайд 2

План доклада Cпектроскопия комбинационного рассеяния Особенности гигантского комбинационного рассеяния Типы наноструктур

План доклада

Cпектроскопия комбинационного рассеяния
Особенности гигантского комбинационного рассеяния
Типы наноструктур и примеры их

применения
Наноструктуры мечты
Наноструктурированные поверхности: получение дальнодействующего усиления на примере изучения митохондрий
Слайд 3

Комбинационное рассеяние (КР, или эффект Рамана) – это неупругое рассеяние света

Комбинационное рассеяние (КР, или эффект Рамана)
– это неупругое рассеяние света

на молекулах вещества с изменением частоты излучения

M.J. Baker et al. (2015) Chem Soc rev

Δν = νвозб. – νКР
Частотный сдвиг, см-1

Слайд 4

Спектр КР несет информацию о переходах между колебательными подуровнями, то есть

Спектр КР несет информацию о переходах между колебательными подуровнями, то есть

о колебаниях атомов. Следовательно:
Каждому колебанию атомов в молекуле соответствует свой пик на спектре КР
КР уникален для каждой молекулы, т.е. представляет собой «молекулярные отпечатки»
По спектрам КР можно оценить конформационные перестройки в молекулах и изменения микроокружения групп атомов

Li D.-W. et al. (2014). Microchimica Acta

Какую информацию извлекают из спектров КР

Частотный сдвиг, см-1

Слайд 5

Okada et al., PNAS, 2012 КР-карта распределения веществ в клетке в

Okada et al., PNAS, 2012

КР-карта распределения веществ в клетке в псевдо-цвете

в норме и при апоптозе: цитохром С, белки, липиды

Возможности КР: картирование клеток label-free

Слайд 6

КР позволяет исследовать молекулы даже в целых органах ex vivo N.А. Brazhe et al., 2013

КР позволяет исследовать молекулы даже в целых органах ex vivo

N.А. Brazhe

et al., 2013
Слайд 7

M, Jermyn et al. 2015 КР позволяет исследовать молекулы даже в целых органах in situ

M, Jermyn et al. 2015

КР позволяет исследовать молекулы даже в целых

органах in situ
Слайд 8

Brazhe et al. 2018

Brazhe et al. 2018

Слайд 9

Основная проблема КР – низкая интенсивность

Основная проблема КР – низкая интенсивность

Слайд 10

КР, усиленное наноструктурами металлов ГКР позволяет получить огромное усиление КР до

КР, усиленное наноструктурами металлов
ГКР позволяет получить огромное усиление КР до 14

порядков от молекул, помещенных в непосредственной близости (в т.ч. на поверхности) металлических наноструктур (Ag, Au, Pt, Cu).
Усиления ГКР:
1) Электромагнитное
2) Химическое (при адсорбции молекул)

Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР)
Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)

TERS SERS

Слайд 11

Высокое разрешение (ГКР возникает локально – только на небольшом расстоянии от

Высокое разрешение (ГКР возникает локально – только на небольшом расстоянии от

наночастиц);
Огромное усиление спектров КР от молекул вблизи наноструктур;
Возможность исследовать малейшие концентрации веществ и даже единичные молекулы;
Нет выгорания (в отличие от флуоресценции);
Не требует меток (*)

Преимущества ГКР

Слайд 12

Усиление сигнала ГКР от молекул может сильно варьировать во времени в

Усиление сигнала ГКР от молекул может сильно варьировать во времени в

связи с факторами:
Агрегация наночастиц
Изменение конформации молекулы при адсорбции на поверхность наночастицы
Наночастицы могут быть токсичны для клеток
Клетки и физиологические буферы могут «портить» наночастицы
К каждому новому объекту – новый подход…

Трудности

SERS is pain!

Слайд 13

Молекулярные сенсоры (с молекулой-репортером) Наночастицы для усиления сигнала КР от молекул

Молекулярные сенсоры (с молекулой-репортером)

Наночастицы для усиления сигнала КР от молекул

Работа с

низкой концентрацией молекул

Молекулы внутри клеток и органелл!

Распределение молекул? высокое разрешение!

pH- и
глюкозо-
метры

Типы наноструктур

iSERS
(иммуноГКР)

Никельшпарг Э.И. Спектроскопия КР: новые возможности старого метода/ биомолекула.ру

Слайд 14

Иммуно-ГКР Сочетает в себе специфичность иммунохимии и чувствительность ГКР

Иммуно-ГКР

Сочетает в себе специфичность иммунохимии и чувствительность ГКР

Слайд 15

anti-ICAM-1 (purple), anti-VCAM-1 (red), and anti-P-selectin (blue) Иммуно-ГКР: трёхцветное ГКР-изображение срезов

anti-ICAM-1 (purple), anti-VCAM-1 (red), and anti-P-selectin (blue)

Иммуно-ГКР: трёхцветное ГКР-изображение срезов

жировой ткани при внутривенном введении нано-меток

J. Noonan et al., Theranostics, 2018

Слайд 16

ГКР рН-метры Картирование клеток с помощью молекул-репортеров, адсорбированных на наночастицы при

ГКР рН-метры
Картирование клеток с помощью молекул-репортеров, адсорбированных на наночастицы

при эндосомальном введении

Никельшпарг Э.И. Спектроскопия КР: новые возможности старого метода/ биомолекула.ру

Слайд 17

ГКР рН-метры Картирование клеток по кислотности с помощью 4-меркаптобензойной кислоты, адсорбированной

ГКР рН-метры
Картирование клеток по кислотности с помощью
4-меркаптобензойной кислоты,

адсорбированной на золотые наношарики

J. Kneipp et al / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 6 (2010) 214–226

Слайд 18

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

наноструктуры

В зависимости от наноструктур от r3 до r10

1

2

Слайд 19

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

наноструктуры

В зависимости от наноструктур от r3 до r10

1

2

Слайд 20

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

наноструктуры

В месте соприкосновения наноструктур/острых граней/впадин/выпуклостей образуется т.н. «горячая точка» (hot spot) с наибольшим усилением сигнала

1

2

Слайд 21

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от

наноструктуры

1

2

В месте соприкосновения наноструктур/острых граней/впадин/выпуклостей образуется т.н. «горячая точка» (hot spot) с наибольшим усилением сигнала

Слайд 22

Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением! 1 2

Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением!

1

2

Слайд 23

1 2 Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением!

1

2

Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением!

Слайд 24

А Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al.

А

Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al. (2016)

Гладкая

поверхность не дает усиления ГКР
Слайд 25

Исследование митохондрий Детекция бактерий Эритроцитов Наноструктурированные поверхности Получение дальнодействующего усиления сигнала

Исследование митохондрий

Детекция бактерий

Эритроцитов

Наноструктурированные поверхности

Получение дальнодействующего усиления сигнала за счет плазмонного резонанса.
Меньше

требований к токсичности (ничего не проникает в клетку/органеллу)
Слайд 26

С

С

Слайд 27

Слайд 28

Белковая часть гем Цитохромы состоят из белковой части и гема

Белковая часть

гем

Цитохромы состоят из белковой части и гема

Слайд 29

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger Principles of

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger Principles of

Biochemistry.

Гемы различных цитохромов очень похожи: порфириновое кольцо с железом + боковые радикалы

Слайд 30

II Матрикс Внутренняя мембрана Межмембранное Пространство (ММП) IV V с Внешняя мембрана Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ)

II

Матрикс

Внутренняя мембрана

Межмембранное
Пространство (ММП)

IV

V

с

Внешняя мембрана

Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ)

Слайд 31

NAD+ NADH фумарат сукцинат H2O О2 QH2 QH2 ЭТЦ получает электроны

NAD+

NADH

фумарат

сукцинат

H2O

О2

QH2

QH2

ЭТЦ получает электроны от цикла Кребса через КI (NADH) и КII

(сукцинат)

Цикл
Кребса

Слайд 32

NAD+ NADH фумарат сукцинат H2O О2 QH2 QH2 ЭТЦ получает электроны

NAD+

NADH

фумарат

сукцинат

H2O

О2

QH2

QH2

ЭТЦ получает электроны от цикла Кребса через КI (NADH) и КII

(сукцинат)

Цикл
Кребса

с

QH2

QH2

2H+

2H+

с

Слайд 33

NAD+ NADH фумарат сукцинат H2O О2 QH2 QH2 Перенос электронов сопровождается

NAD+

NADH

фумарат

сукцинат

H2O

О2

QH2

QH2

Перенос электронов сопровождается переносом протонов, что является движущей силой для синтеза

АТФ

Цикл
Кребса

с

QH2

QH2

2H+

2H+

с

ATФ

AДФ+Ф

H+

H+

H+

H+

H+

H+

Слайд 34

NAD+ NADH фумарат сукцинат H2O О2 QH2 QH2 Цитохромы (переносчики электронов)

NAD+

NADH

фумарат

сукцинат

H2O

О2

QH2

QH2

Цитохромы (переносчики электронов) – гемовые белки; обладают интенсивным КР

Цикл
Кребса

с

QH2

QH2

2H+

2H+

с

ATФ

AДФ+Ф

H+

H+

H+

H+

H+

H+

b

Слайд 35

Ma et. al., Biochemistry. 1998 Solmaz S.R.N. and Hunte C. J.BiolChem,

Ma et. al., Biochemistry. 1998

Solmaz S.R.N. and Hunte C. J.BiolChem,

2008

Цитохром с

Цитохром с1

Гем С

Конформация
гема

Белок

Ориентация

Перенос электрона

Слайд 36

R.V. Chertkova et al., PLoS One, 2017 Скрученная конформация Sun et

R.V. Chertkova et al., PLoS One, 2017

Скрученная конформация
Sun et al. PNAS,

2014

Чем более скручен гем – тем хуже он переносит электроны

Слайд 37

А Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al. (2016)

А

Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al. (2016)

Слайд 38

Слайд 39

H2O О2 QH2 QH2 Дальнодействующее усиление сигнала позволило зарегистрировать спектры ГКР

H2O

О2

QH2

QH2

Дальнодействующее усиление сигнала позволило зарегистрировать спектры ГКР только от
окисленного цитохрома

С

с

QH2

QH2

2H+

2H+

с

ATФ

AДФ+Ф

H+

H+

H+

H+

H+

H+

7 нм

10 нм

с

3 нм

Усиление до 15 нм

b

Слайд 40

Гем цитохрома с Колебания метиновых мостиков Колебания пиррольных колец Колебания боковых

Гем
цитохрома с

Колебания
метиновых
мостиков

Колебания
пиррольных
колец

Колебания боковых
радикалов

Спектр гигантского комбинационного рассеяния

(ГКР) цитохрома С
Слайд 41

Спектр гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) митохондрий является спектром окисленного гема цитохрома C

Спектр гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) митохондрий является спектром окисленного гема цитохрома

C
Слайд 42

Предложенный подход на основе ГКР Позволяет регистрировать сигнал от окисленного цитохрома

Предложенный подход на основе ГКР

Позволяет регистрировать сигнал от окисленного цитохрома С

внутри интактных митохондрий;
Предоставляет уникальную информацию о конформации гема в цитохроме С внутри функционирующей митохондрии, что невозможно получить другими методами;
Чувствителен к функциональному состоянию митохондрий;

Brazhe et al. (2015) Scientific reports

Слайд 43

Заключение Комбинационное рассеяние позволяет детектировать молекулы с большой чувствительностью; Для каждой

Заключение

Комбинационное рассеяние позволяет детектировать молекулы с большой чувствительностью;
Для каждой молекулы уникальный

спектр КР - «Молекулярный отпечаток»;
По спектрам КР можно выявить изменения конформации молекулы;
Гигантское комбинационное рассеяние – это КР, усиленное наноструктурами металлов;
ГКР предоставляет большие возможности для изучения внутриклеточных молекул и значительный диагностический потенциал, но успех во многом зависит от оптимизации наноструктур.