Место проточной цитофлюориметрии в клинической онкогематологии

диагноз
классификация
оценка факторов риска
определение МОБ

методы диагностики

цитометрия сегодня
Проточная цитометрия-измерение параметров отдельных клеток, пересекающих одна за

принцип метода
иммунологическая реакция антиген/антитело
особенность: АТ коньюгированы с флюорохромом

диагностика онкогематологических заболеваний
оценка минимальной остаточной болезни (МОБ)
оценка качества трансплантата гемопоэтических клеток
определение

-панцитопения
-морфологически выявленные атипичные клетки или бласты
-лейкоцитоз
-плазмацитоз
-лимфоаденопатия
-органомегалия
-наблюдение в динамике за пациентами

эволюция проточной цитометрии

микроскопия
химические красители
электороника
компьютерная техника.

исторические «вехи»

1590 микроскоп A. Leewenhowk
1742 светорассеяние М.Ломоносов
1880 технология окрашивания P.Erlich
Стабильность

Albert Coons

концепция иммунофлюоресценции
1940-е

получение моноклональных антител 1975

Georges J.F. Köhler

César Milstein

1985

лазер
488 нм
635 нм

FL2 PE

SSC

FSC

FL3 PerCP

FL1 FITC

FL4 APC

элементы цитометра

"pulse cytophotometry"
(''Impulszytophotometrie'').

flow cytomerty 1988

периферическая кровь

Параметры гистограммы

FITC FL

PE FL

Негативная популяция

Популяция позитивная по FITC

Популяция,позитивная по PE

Дубль позитивная

параметры гистограммы

3-/4+

3+/Y-

3+/4+

3-/4-

Материал для исследования

периферическая кровь
костный мозг
ликвор
любая суспензия клеток

доставка и хранение
кровь и КМ : а/коагулянт гепарин, ЭДТА
плевральная, асцитическая жидкости,

Гепарин vs ЭДТА

Гепарин - после выделения клеток на Ficoll можно

хранение

комнатная ? (18 to 22 C)
хранение при T<10 0C может

антигенная клеточная структура
Париж 1982
1 международное совещание
« Human

этапы цитофлюориметричекского

анализируемый образец
комбинация антител с различными флюорохромами для выявления маркеров интереса

лизирующий

выбор коньюгатов

выбор флюорохрома зависит от плотности антигена на клетке

проблемы

потеря клеток во время «отмывания»
неполный лизис, много «debris»: липидемия,↑ретикулоцитов
( криоглобуленемия),

EGIL
European Group for Immunophenotypic characterization of Leukemias

WHO 2008

РМАПО

Consensual European Immunophenotyping panels for Leukemia  

Should be able to recognize
(должны

Should be able to recognize features compamatible with
(должны быть способны распознать

антигены

Панлекоцитарный : CD45
Линейно неограниченные: СD34, CD 38, CD133, HLA-DR
Линейно ассоциированные:
-миелоидной

выявление антигенов

на мембране клетки

в цитоплазме

асинхронная – одновременная экспрессия антигенов разной стадии дифференцировки : CD34+/CD22+
аберрантная -

Как определить линейность?

MPO + CD33/13 117= миелоидный
cytCD79a/cytCD22+CD19= В-линейный
Cyt СD3+CD7= Т-линейный
НО!!
ОМЛ с

«внутренняя проверка достоверности»

Т-линия CD2=CD3=CD5=CD7
В-линия CD19=CD20= CD22 (CD23 ,FMC7 реагируют с субпопуляцией)
моноциты

домашнее задание!

HLA-DR

TdT/CD34

CD19

CD10

CD5

CD20

CD38

CD79a

CD22

лимф. стволовая клетка

Про-В

Пре-В

промежуточная
В-клетка

плазматическая В-клетка

зрелая В-клетка

cyIgM

sIg

cyCD22

дифференцировка В-лимфоцитов

CD138

TdT

CD4/8

CD4 или CD8

CD1a

протимоцит

common
тимоцит

зрелый
тимоцит

активированный
Т-лимфоцит

хелперный/
супрессорный
T-лимфоцит

sCD3

CD5

дифференцировка Т-лимфоцитов

HLA-DR

cyCD3

CD2, CD7

Лимфоидная стволовая
клетка

миелоидная дифференцировка

моноцитарная дифференцировка

Периферическая кровь

Костный мозг