Развитие исследований: от гена до функции

Развитие исследований: от гена до функции

Genomics

Секвенирование генов, экспрессионный анализ, сайт-специфический

Структурная и функциональная протеомика

Задачи исследователя:
Определение структуры белка
Определение функций белка / антитела
Регуляция
Межмолекулярные

Структурная протеомика 2 разных подхода
LC-MS: смесь белков → определение пептидов в смеси
Разделение

Функциональная протеомика

Фундаментальные исследования взаимодействий:
Изучение кинетики и аффинности взаимодействий молекул
Задачи: изучение каскадов

Двумерный электрофорез

2D электрофорез – незаменимый классический метод в протеомных исследованиях, «входной

2D-электрофорез: этапы.

MS

Двумерный электрофорез – результат?

2-D DIGE для экспрессионной протеомики

Традиционный 2D электрофорез
Трудозатратный, большие вариации внутри

Difference gel electrophoresis (DIGE)

Cy3 Mouse proteins
control

Cy2 Mouse liver proteins
Internal standard

Overlay Mouse liver proteins

Cy5 Mouse liver proteins
treated

8 образцов: 8 гелей x 3 повтора = 24 геля

2D-DIGE (3-цветный)

Традиционный

Функциональная протеомика

Biacore™ - биосенсоры SPR
MicroCal™ - калориметр

Анализ взаимодействия молекул:

- Без метки
- В

Анализ взаимодействия различных молекул:

Белки
Нуклеиновые кислоты
Липиды и мембран-ассоциированные молекулы
Углеводы
Низкомолекулярные соединения
Целые клетки
Вирусы/бактерии

Biacore. SPR. Используются в ведущих академических и биотехнологических лабораториях с 1990 г.

Система

Сенсограмма SPR

В шприце - лиганд (связываемое соединение)
В экспериментальной ячейке - целевой белок
В

Около 20 лет на рынке – более 10 000 научных публикаций

Онкология
Нейробиология
Иммунология
Инфекционные

High Content Analysis (HCA) это…

Анализ «высокого содержания»
Получение большого количества разноплановых

Эволюция клеточного анализа

Деструктивный

Электрофорез

Фиксированный

Трансдукция сигнала

Динамический

Процессы в клетке

Интегрированный

Взаимодействия

Информа-
Тивноcть

Зачем нужен HCA?

Исследования:

Изучение функции, локализации и кинетики в живой

Cytometry

Western blotting

Универсальность и возможности

Электрофорез

Цитофлуориметр

Микроскопия

Основные компоненты HCA

Реактивы
Флуоресцентные метки

Оборудование
Инструмент для визуализации фиксированных и живых клеток
Дополнительные модули

IN Cell Analyzer 2200, 6000

Высоко-производительная камера

Стандартная CCD-камера
1.4 Mp CoolSNAP ES2
1392 x 1040 пикс.
6.45мкм кв.

Новейшая технология восстановления
изображения (Деконволюция)

3 режима проходящего света

микроскопия светлого поля
фазово-контрастная микроскопия
ДИК (дифференциально-интерференционный
контраст) для

Данные от одной клетки до популяции

Spotfire – интерактивное получение изображений

Движение клеток

Рост клеток

Клеточная токсичность

Рост клеток

Области применения

Активация рецептора
Токсикологический ответ клетки и апоптоз
Трансдукция внутриклеточного сигнала

Данные пользователей на IN Cell Analyzer

NIH-3T3 fibroblasts overexpressing src causing localization

Данные пользователей на IN Cell Analyzer

Primary pig trabecular meshwork cells stained for

Качество изображений – это основа

Формирование ядрышка

Срезы тканей
(семенники мыши)

Структура цитоскелета
(Актин, тубулин)

GFP репортеры
(AKT