Микроскопия сверхразрешения: STED,SIM, RESOLFT. Лекция 8

Июль 27, 2022

Главная
Медицина
Микроскопия сверхразрешения: STED,SIM, RESOLFT. Лекция 8

Содержание

2. Диск Эри и проблема разрешения
3. Дифракционный предел в микроскопии Сигнал от точечного источника превращается в диск Эри. Разрешение традиционного микроскопа ограничивается
4. Увеличение разрешающей способности флуоресцентной микроскопии Возбуждение субдифракционного объема STED – stimulated emission depletion RESOLFT – resolution
5. А. Процесс вынужденной и спонтанной эмиссии. Когда флуорофор поглощает фотон возбуждающего света, он переходит из основного
6. STED микроскопия, принцип Источник света – Ti:Sapphire пикосекундный лазер. Флуоресценция на периферии диска Эри подавляется гасящим
7. STED микроскопия Возбуждение осуществляется с помощью пикосекундного лазерного импульса, который настроен на максимум поглощения красителя, и
8. STED микроскопия Исходная интенсивность Интенсивность Истощающего пучка Результирующая интенсивность
9. Размер пятна При максимальной интенсивности гасящего пятна остаточный размер пятна возбуждения определяется соотношением интенсивностей (I/Is). При
10. STED микроскопия – вид перетяжки
11. Микротрубочки Конфокальный микроскоп STED
12. Разрешающая способность в режиме STED Imax – мощность гасящего импульса; Is – мощность возбуждающего импульса
13. Меченные GFP вирусные частицы (диаметр – 40 нм)
14. STED позволяет регулировать разрешение
15. Dual color STED with 660 NUP153 Alexa 532 Clathrin TMR, HeLa cells
16. Dual color STED with 660 NUP153 Alexa 532 Clathrin TMR HeLa cells STED Confocal
17. Triple color 660 nm gated STED Confocal Please enter the titel here l Multicolor STED HeLa
18. Advanced multi coloring: Gated STED allows to use further red shifted fluorphores
19. Объектив для STED HC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITE Based on the Leica CS2 objective
20. Объектив для STED – характеристики HC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITE
21. Регулируемая область возбуждения Расчетный вид перетяжки при различных настройках обжимающего пучка. Слева – стандартная перетяжка для
22. STED – ограничения Малый шаг (около 20 нм) – следовательно большое время сканирования поля зрения. Для
23. Reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) superresolution microscopy
24. Микроскопия суперразрешения - RESOLFT Решетка для «тормозящего» освещения имеет максимумы и минимумы. Эффективная флуоресценция достигается в
25. RESOLFT – кератиновые филаменты
26. Микроскопия суперразрешения - RESOLFT Оценка возможностей метода: Шаг сканирования – от 25 до 40 нм. Время
27. Переключение белков Основная проблема – подбор «хорошего» флуоресцентного белка с малым временем переключения (мутанты красных белков).
28. Двухцветная микроскопия RESOLFT Wide-field and RESOLFT recording of HeLa cells expressing keratin19-rsCherryRev1.4 (red) and vimentin-Dronpa-M159T (green).
29. Приближение к дифракционному пределу в цифровой микроскопии 1. Сканирование с малым шагом в конфокальной микроскопии (менее
30. Структурированное освещение – SIM Structured illumination microscopy – разрешение увеличивается за счет компьютерного анализа муарового рисунка,
31. Микроскопия структурированного освещения. На трех исходных изображениях (A—C) видно, что при перемещении решетки (обозначено черной линией)
32. November 20, 2018 2D-SIM light-path
33. N-SIM микроскопия SIM – structured illumination microscopy. Объект освещается через специальную решетку, последовательные кадры, полученные с
34. SIM - примеры Оболочка ядра, хроматин и ядерные поры.
35. 3D-SIM Профазное ядро в различных проекциях. Хроматин (красный) и ядерные поры.
36. Преодоление дифракционного предела в микроскопии 1. Восстановление центров дисков Эри (центроидов) на множестве кадров (~30000) при
37. Локализация отдельных молекул – PALM, STORM В каждом кадре возбуждается не более 0,1% молекул флуорохрома. Таким
38. Преодоление дифракицонного предела в микроскопии 1. Детекция сигнала от отдельных флуоресцирующих молекул – равномерная флуоресценция, которая
39. Локализация точечного источника света в микроскопии Вычисление положения центроида позволяет «преодолеть» дифракционный предел. Точность расчетов определяется
40. Локализация точечного источника света в микроскопии Точность восстановления центроида определяется количеством детектированных фотонов. Погрешность в локализации
41. Восстановление центроидов Пример восстановления центроидов одиночных молекул Су-3. Время накопления – 0,5 с; среднее число фотонов
42. Разрешение в STORM Точность определения позиции центроида (аппроксимрованного двумерным Гауссовым распределением) – стандартное отклонение для гауссианы:
43. Xiaowei Zhuang Howard Hughes Medical Institute Investigator Professor of Chemistry and Chemical Biology, Professor of Physics
44. STORM микроскопия Два лазера (зеленый/красный) и сближенные красители (Су-3/Су-5) – длительность флуоресценции регулируется переключением молекулы Су-5.
45. STORM микроскопия –реконструкция во времени Многократное сканирование образца позволяет постепенно восстановить изображение микротрубочек в фиксированной клетке.
46. Определение положения Две почти параллельные микротрубочки - с помощью STORM (слева) и при обычной микроскопии (справа)
49. STORM микроскопия, 2 цвета Клатриновые пузырьки и микротрубочки
50. 3D-STORM микроскопия Для увеличения разрешения по оси z требуются дополнительные системы, позволяющие зарегистрировать даже небольшую расфокусировку
52. STORM микроскопия, 3D Сравнение обычного и STORM изображений микротрубочек на краю клетки. Справа – увеличенное изображение,
53. 3D-STORM микроскопия Использование двух объективов позволяет повысить разрешение в плоскости x-y до 10 нм, а по
54. Организация актиновых филаментов в ламелле 3D STORM, 2 объектива. Nature methods, 2012
55. PALM микроскопия PALM – photoactivated localization microscopy. Изображение складывается из нескольких тысяч последовательных кадров, в каждом
56. PALM микроскопия PALM – photoactivated localization microscopy. Наиболее эффективное применение метода – с использованием фотоактивируемых флуоресцентных
57. PALM и обычная микроскопия Фокальные контакты в фибробластах
58. Красители для STORM и PALM
59. PALM versus STORM Два метода фундаментально схожи, так как основаны на общем принципе – восстановлении положения
61. Скачать презентацию

Слайд 2

Диск Эри и проблема разрешения

Слайд 3

Дифракционный предел в микроскопии
Сигнал от точечного источника превращается в диск Эри.

Разрешение традиционного микроскопа ограничивается критерием Рэлея (Спарроу), то есть радиусом диска Эри.

Слайд 4

Увеличение разрешающей способности флуоресцентной микроскопии
Возбуждение субдифракционного объема
STED – stimulated emission depletion
RESOLFT

– resolution (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions
Реконструкция положений центроидов молекул
PALM – photoactivated localization microscopy.
STORM – stochastic optical reconstruction microscopy
Light-sheet microscopy

Слайд 5

А. Процесс вынужденной и спонтанной эмиссии. Когда флуорофор поглощает фотон возбуждающего света, он переходит

из основного состояния S0 в возбужденное S1. Спонтанная эмиссия происходит, когда флуорофор возвращается в основное состояние. Вынужденная эмиссия происходит, если флуорофор поглощает фотон с энергией, сравнимой с разницей между основным и возбужденным состоянием. Б. Схематическое изображение STED-микроскопа: свет от возбуждающего и STED-лазера одновременно фокусируются на одном участке образца. В. Распределение интенсивностей возбуждающего лазера и STED-лазера, который подавляет спонтанную флуоресценцию вокруг нулевой точки. В результате сужается функция рассеяния точки

STED – принцип метода

Слайд 6

STED микроскопия, принцип
Источник света – Ti:Sapphire пикосекундный лазер. Флуоресценция на периферии

диска Эри подавляется гасящим импульсом тороидальной формы, который имеет значительно большую мощность. Длительность импульса – 1-100 пс, гасящий импульс длится 200-400 пс. Стимулируемая эмиссия имеет характеристическое время 1 пс, тогда как флуоресценция – 1 нс, то есть в 1000 раз дольше.

Слайд 7

STED микроскопия
Возбуждение осуществляется с помощью пикосекундного лазерного импульса, который настроен на

максимум поглощения красителя, и возбуждает дифракционно ограниченное пятно. Импульс STED имеет красное смещение по частоте спектра излучения красителя, так что его фотоны действуют только на возбужденные молекулы красителя, индуцируя их в состояние вынужденного излучения.
Эффект импульса STED состоит в том, что возбужденные молекулы не могут светиться, потому что их энергия сбрасывается. Импульс STED кольцевой, так что только молекулы на границе диска Эри эффективно гасятся. В центре бублика, где импульс STED исчезает, флуоресценция остается неизменной.

http://www.mpibpc.gwdg.de/groups/hell/

Слайд 8

STED микроскопия
Исходная
интенсивность
Интенсивность
Истощающего
пучка
Результирующая
интенсивность

Слайд 9

Размер пятна
При максимальной интенсивности гасящего пятна остаточный размер пятна возбуждения определяется

соотношением интенсивностей (I/Is).
При типичном соотношении 1:100 размер пятна может быть в 10 раз меньше дифракционного предела.

Слайд 10

STED микроскопия – вид перетяжки

Слайд 11

Микротрубочки
Конфокальный
микроскоп
STED

Слайд 12

Разрешающая способность в режиме STED
Imax – мощность гасящего импульса;
Is –

мощность возбуждающего импульса

Слайд 13

Меченные GFP вирусные частицы (диаметр – 40 нм)

Слайд 14

STED позволяет регулировать разрешение

Слайд 15

Dual color STED with 660
NUP153 Alexa 532
Clathrin TMR,
HeLa cells

Слайд 16

Dual color STED with 660
NUP153 Alexa 532
Clathrin TMR
HeLa cells
STED
Confocal

Слайд 17

Triple color 660 nm gated STED
Confocal
Please enter the titel here
l
Multicolor STED
HeLa

cells
NUP153-Alexa 532
Clathrin-TMR
Actin-Alexa 488

Слайд 18

Advanced multi coloring:
Gated STED allows to use further red shifted fluorphores

Слайд 19

Объектив для STED
HC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITE
Based on the

Leica CS2 objective generation
Optimal chromatic correction enables STED over the full spectrum of visible light

Слайд 20

Объектив для STED – характеристики
HC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITE

Слайд 21

Регулируемая область возбуждения
Расчетный вид перетяжки при различных настройках обжимающего пучка. Слева

– стандартная перетяжка для конфокального режима, справа – при максимально «сбалансированном» режиме STED.

Слайд 22

STED – ограничения
Малый шаг (около 20 нм) – следовательно большое

время сканирования поля зрения.
Для получения малого пятна необходима большая энергия истощающего пучка – существует проблема быстрого фотообесцвечивания. Практический предел – около 100 последовательных кадров (неопубликованные данные).
Разрешение больше, чем величина шага сканирования, и составляет в лучшем случае 40-50 нм.

Слайд 23

Reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) superresolution microscopy

Слайд 24

Микроскопия суперразрешения - RESOLFT
Решетка для «тормозящего» освещения имеет максимумы и минимумы.

Эффективная флуоресценция достигается в областях минимумов интенсивного синего света, вспышка которого (одновременно с возбуждением фиолетовым светом) который гасит большую часть флуоресценции в поле зренияю. Собственно сигнал собирается за счет низкоинтенсивного синего света (широкопольное освещение).

Chmyrov et al., 2014. Nature Methods, 10(8) 737-740

Слайд 25

RESOLFT – кератиновые филаменты

Слайд 26

Микроскопия суперразрешения - RESOLFT
Оценка возможностей метода:
Шаг сканирования – от 25 до

40 нм. Время экспозиции одного кадра – около 20 мсек. Время экспозиции определяется скоростью переключения флуоресцентного белка.
Общее число кадров – 60-120. Оно определяется фото-стабильностью белка (максимальным числом циклов on-off).
Суммарное время получения изображения – 1-4 сек.
Размер поля зрения – 50-120 мкм.
Разрешение, определяемое по FWHM, составляет 70-120 нм.
Основная проблема – подбор «хорошего» флуоресцентного белка (мутанты EGFP, Dronpa).

Chmyrov et al., 2014. Nature Methods, 10(8) 737-740

Слайд 27

Переключение белков
Основная проблема – подбор «хорошего» флуоресцентного белка с малым временем

переключения (мутанты красных белков).

Lavoie-Cardinal et al., 2014. ChemPhysChem 2014, 15, 655 – 663

Слайд 28

Двухцветная микроскопия RESOLFT
Wide-field and RESOLFT recording of HeLa cells expressing

keratin19-rsCherryRev1.4 (red) and vimentin-Dronpa-M159T (green). The RESOLFT images were taken with 100 scanning steps. Each frame was acquired with a total imaging time of ~4 s for the green channel and ~19 s for the red channel. Right -- magnification of the regions marked in left and middle, respectively. j) Line profiles across the region between the arrows marked above. The solid lines represent Gaussian fits. Scale bars: 5 μm and 500 nm .

Слайд 29

Приближение к дифракционному пределу в цифровой микроскопии
1. Сканирование с малым шагом

в конфокальной микроскопии (менее 1/5 диска Эри).
2. Структурированное освещение (SIM) и съемка последовательных изображений.
В обоих случаях конечное изображение восстанавливается компьютерными методами.

Слайд 30

Структурированное освещение – SIM
Structured illumination microscopy – разрешение увеличивается за

счет компьютерного анализа муарового рисунка, возникающего при многократном (9-15 кадров) косом освещении препарата через специальную смещающуюся решетку.
Преобразование исходного изображения проводится в пространстве Фурье, а конечное изображение восстанавливается с помощью обратного преобразования Фурье. Параметры преобразования задаются вручную.

Слайд 31

Микроскопия структурированного освещения. На трех исходных изображениях (A—C) видно, что при перемещении решетки

(обозначено черной линией) интенсивность флуоресценции объектов, расположенных в фокусе, заметно меняется. Флуоресценция, исходящая от других оптических слоев, практически не меняется (обозначено белой стрелкой), что позволяет избавиться от нее за счет компьютерной обработки (D).

Слайд 32

November 20, 2018
2D-SIM light-path

Слайд 33

N-SIM микроскопия
SIM – structured illumination microscopy. Объект освещается через специальную решетку,

последовательные кадры, полученные с ее помощью, обрабатываются компьютером. Предел разрешения – около 120 нм.

Слайд 34

SIM - примеры
Оболочка ядра, хроматин и ядерные поры.

Слайд 35

3D-SIM
Профазное ядро в различных проекциях. Хроматин (красный) и ядерные поры.

Слайд 36

Преодоление дифракционного предела в микроскопии
1. Восстановление центров дисков Эри (центроидов) на

множестве кадров (~30000) при случайном возбуждении отдельных молекул (STORM, PALM).
2. Сканирование с малым шагом при подавлении флуоресценции на периферии диска Эри дополнительным излучением (STED).

Слайд 37

Локализация отдельных молекул – PALM, STORM
В каждом кадре возбуждается не более

0,1% молекул флуорохрома. Таким образом, расстояние между ними оказывается достаточно велико для идентификации положения каждой из них.

Слайд 38

Преодоление дифракицонного предела в микроскопии
1. Детекция сигнала от отдельных флуоресцирующих молекул

– равномерная флуоресценция, которая внезапно полностью гаснет.
2. Установка камеры на оптимальный эквивалентный размер пиксела – он составляет около 100 нм.
3. Восстановление центров дисков Эри (центроидов) на множестве кадров (~30000).
4. Суперразрешение (погрешность в определении центроида) определяется в первую очередь количеством фотонов от каждой молекулы флуорохрома.

Слайд 39

Локализация точечного источника света в микроскопии
Вычисление положения центроида позволяет «преодолеть» дифракционный

предел. Точность расчетов определяется числом фотонов, попавших на матрицу.

Слайд 40

Локализация точечного источника света в микроскопии
Точность восстановления центроида определяется количеством детектированных

фотонов. Погрешность в локализации молекулы уменьшается в ростом времени накопления сигнала.

Слайд 41

Восстановление центроидов
Пример восстановления центроидов одиночных молекул Су-3. Время накопления – 0,5

с; среднее число фотонов – около 30000.

Слайд 42

Разрешение в STORM
Точность определения позиции центроида (аппроксимрованного двумерным Гауссовым распределением) –

стандартное отклонение для гауссианы:
Thompson RE et al., 2002
Соответственно, разрешение примерно в 2,5 раза хуже.

Слайд 43

Xiaowei Zhuang Howard Hughes Medical Institute Investigator Professor of Chemistry and Chemical Biology, Professor

of Physics Harvard University

STORM микроскопия, 2006

Слайд 44

STORM микроскопия
Два лазера (зеленый/красный) и сближенные красители (Су-3/Су-5) – длительность флуоресценции

регулируется переключением молекулы Су-5.
Запись широкопольного изображения идет со скоростью около 20 кадров в секунду на EMCCD камеру (время накопления сигнала – около 40 мс, число квантов – от 600 до 3000). С КМОП камерой – до 200 кадров в секунду.
Программа производит автоматическое восстановление центроидов при случайном возбуждении отдельных молекул флуорохрома. Достигнутая точность – около 25 нм.
Синтез полного изображения проводится по рассчитанным центроидам (порядка 10000-30000 кадров).
Общее время получения одного кадра (оптического среза) – около 2-20 минут.

Слайд 45

STORM микроскопия –реконструкция во времени
Многократное сканирование образца позволяет постепенно восстановить изображение

микротрубочек в фиксированной клетке. Краситель – Alexa-647. Формат кадра – 64х64 пиксела. Эквивалентный размер пиксела – 140 нм. Частота сканирования – 1 кГц; восстановлено точек излучения (молекул) – около 730 тыс.

Слайд 46

Определение положения
Две почти параллельные микротрубочки - с помощью STORM (слева) и

при обычной микроскопии (справа)

Слайд 47

Слайд 48

Слайд 49

STORM микроскопия, 2 цвета
Клатриновые пузырьки и микротрубочки

Слайд 50

3D-STORM микроскопия
Для увеличения разрешения по оси z требуются дополнительные системы, позволяющие

зарегистрировать даже небольшую расфокусировку диска Эри.

Слайд 51

Слайд 52

STORM микроскопия, 3D
Сравнение обычного и STORM изображений микротрубочек на краю клетки.

Справа – увеличенное изображение, на котором видны отдельные молекулы в составе микротрубочек (3 проекции).

Слайд 53

3D-STORM микроскопия
Использование двух объективов позволяет повысить разрешение в плоскости x-y до

10 нм, а по оси z – до 20 нм. Высокое разрешение по оси z достигается за счет использования цилиндрических линз.

Слайд 54

Организация актиновых филаментов в ламелле
3D STORM, 2 объектива. Nature methods, 2012

Слайд 55

PALM микроскопия
PALM – photoactivated localization microscopy.
Изображение складывается из нескольких тысяч

последовательных кадров, в каждом из которых возбуждается (активируется) не более 0,1-1% флуоресцирующих молекул. Для каждой из молекул компьютером восстанавливается положение ее центроида.
Наиболее эффективное применение метода –использование фотоактивируемых или мерцающих с высокой частотой флуоресцентных белков.
Ограничение метода – скорость переключения и фотостабильность молекул.

Слайд 56

PALM микроскопия
PALM – photoactivated localization microscopy.
Наиболее эффективное применение метода –

с использованием фотоактивируемых флуоресцентных белков. Один лазер используется для фотоактивации, второй – для возбуждения флуоресценции и обесцвечивания.

Слайд 57

PALM и обычная микроскопия
Фокальные контакты в фибробластах

Слайд 58

Красители для STORM и PALM

Слайд 59

PALM versus STORM
Два метода фундаментально схожи, так как основаны на общем

принципе – восстановлении положения отдельных молекул за счет их кратковременной флуоресценции.
Различия:
В PALM внешняя фотоактивация и фотообесцвечи-вание ограничивают свечение флуорофора. От белка требуется лишь высокая фотостабильность.
В STORM случайные спонтанные переходы флуорофора из светящегося в «темное» состояние используются для того, чтобы различить соседние молекулы. Поэтому от красителя требуется высокая собственная частота мерцаний.

Микроскопия сверхразрешения: STED,SIM, RESOLFT. Лекция 8

Содержание

Диск Эри и проблема разрешения

Дифракционный предел в микроскопииСигнал от точечного источника превращается в диск Эри.

Увеличение разрешающей способности флуоресцентной микроскопииВозбуждение субдифракционного объемаSTED – stimulated emission depletionRESOLFT

А. Процесс вынужденной и спонтанной эмиссии. Когда флуорофор поглощает фотон возбуждающего света, он переходит

STED микроскопия, принципИсточник света – Ti:Sapphire пикосекундный лазер. Флуоресценция на периферии

STED микроскопияВозбуждение осуществляется с помощью пикосекундного лазерного импульса, который настроен на

STED микроскопияИсходнаяинтенсивностьИнтенсивностьИстощающегопучкаРезультирующая интенсивность

Размер пятнаПри максимальной интенсивности гасящего пятна остаточный размер пятна возбуждения определяется

STED микроскопия – вид перетяжки

Микротрубочки Конфокальный микроскопSTED

Разрешающая способность в режиме STEDImax – мощность гасящего импульса; Is –

Меченные GFP вирусные частицы (диаметр – 40 нм)

STED позволяет регулировать разрешение

Dual color STED with 660NUP153 Alexa 532Clathrin TMR, HeLa cells

Dual color STED with 660NUP153 Alexa 532Clathrin TMRHeLa cellsSTEDConfocal

Triple color 660 nm gated STEDConfocalPlease enter the titel herelMulticolor STEDHeLa

Advanced multi coloring:Gated STED allows to use further red shifted fluorphores

Объектив для STEDHC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITEBased on the

Объектив для STED – характеристикиHC PL APO 100x/1.40 OIL STED WHITE

Регулируемая область возбужденияРасчетный вид перетяжки при различных настройках обжимающего пучка. Слева

STED – ограничения Малый шаг (около 20 нм) – следовательно большое

Reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) superresolution microscopy

Микроскопия суперразрешения - RESOLFTРешетка для «тормозящего» освещения имеет максимумы и минимумы.

RESOLFT – кератиновые филаменты

Микроскопия суперразрешения - RESOLFTОценка возможностей метода:Шаг сканирования – от 25 до

Переключение белковОсновная проблема – подбор «хорошего» флуоресцентного белка с малым временем

Двухцветная микроскопия RESOLFT Wide-field and RESOLFT recording of HeLa cells expressing

Приближение к дифракционному пределу в цифровой микроскопии1. Сканирование с малым шагом

Структурированное освещение – SIM Structured illumination microscopy – разрешение увеличивается за

Микроскопия структурированного освещения. На трех исходных изображениях (A—C) видно, что при перемещении решетки

November 20, 20182D-SIM light-path

N-SIM микроскопияSIM – structured illumination microscopy. Объект освещается через специальную решетку,

SIM - примеры Оболочка ядра, хроматин и ядерные поры.

3D-SIM Профазное ядро в различных проекциях. Хроматин (красный) и ядерные поры.

Преодоление дифракционного предела в микроскопии1. Восстановление центров дисков Эри (центроидов) на

Локализация отдельных молекул – PALM, STORMВ каждом кадре возбуждается не более

Преодоление дифракицонного предела в микроскопии1. Детекция сигнала от отдельных флуоресцирующих молекул

Локализация точечного источника света в микроскопииВычисление положения центроида позволяет «преодолеть» дифракционный

Локализация точечного источника света в микроскопииТочность восстановления центроида определяется количеством детектированных

Восстановление центроидовПример восстановления центроидов одиночных молекул Су-3. Время накопления – 0,5

Разрешение в STORMТочность определения позиции центроида (аппроксимрованного двумерным Гауссовым распределением) –