Особенности кинетики аллостерических ферментов

Содержание

Слайд 2

АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ «аллос» (греч.) – другой, «стерео» (греч.) – пространственный. Аллостерические

АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

«аллос» (греч.) – другой, «стерео» (греч.) – пространственный.

Аллостерические ферменты – особая категория ферментов, их функция – регуляция активности метаболических путей («ключевые» ферменты).
Активность аллостерических ферментов регулируется, в основном, с помощью аллостерических регуляторов (активаторов и ингибиторов). Эффект этих регуляторов проявляется чрезвычайно быстро. Возможна также регуляция активности под влиянием концентрации собственного субстрата.
Аллостерические регуляторы не обладают структурным сход-ством с субстратом. Эти регуляторы с высоким сродством нековалентно (обратимо) связываются со специальными сайта-ми, лежащими за пределами активного (каталитического) центра молекулы аллостерического фермента. Регуляторы действуют в низких концентрациях.
Теория аллостерических ферментов была разработана в 1956-1963 гг. Амбуржье, Моно, Шанжё и Жакобом.
Слайд 3

Особенности строения и функционирования: состоят из нескольких субъединиц (оли- гомерные белки);

Особенности строения и функционирования:
состоят из нескольких субъединиц (оли-
гомерные белки);

содержат два типа пространственно раз-
деленных связывающих центров:
I тип: несколько активных (каталитических)
центров – чаще всего по количеству
субъединиц ;
II тип: несколько регуляторных (аллостери-
ческих) центров, предназначенных для
специфического связывания аллостеричес-
ких регуляторов: активаторов и ингибиторов.
Слайд 4

аллостерические регуляторы не обладают структурным сходством с субстратом (это послужило основанием

аллостерические регуляторы не обладают структурным сходством с субстратом (это послужило основанием

для появления термина аллостерический);
не подчиняются кинетике Михаэлис-Ментен. График зависимость скорости ферментати-вной реакции от концентрации субстрата имеет сигмовидную (S-образную) форму;
Слайд 5

сигмовидная форма кривой обусловлена тем, что связывание субстрата в одном каталитическом

сигмовидная форма кривой обусловлена
тем, что связывание субстрата в одном

каталитическом центре всегда приводит
к увеличению сродства к субстрату вто-
рого каталитического центра. Это проис-
ходит опосредованно – через изменение
конформации второго каталитического
центра.
Так проявляется кооперативность взаимо-действия между активными (каталитически-ми) центрами в молекуле аллостерического фермента.
Слайд 6

Гемоглобин – первый белок, на примере которого было открыто явление кооператив-ности

Гемоглобин – первый белок, на примере которого было открыто явление

кооператив-ности во взаимодействии связывающих О2 центров. Много позже кооперативность была выявлена для других белков и аллостеричес-ких ферментов.
Кооперативность – согласованное взаимодействие между центрами субъединиц в процессе связывания с ними лигандов, приводящее к изменению сродства лиганда к центру.
Кооперативность широко распространена в живой природе. Она описана при функционировании многих белков и нуклеиновых кислот.
Слайд 7

Кривая насыщения О2 для гемоглобина Степень насыщения участков, связывающих кислород (Y),

Кривая насыщения О2 для
гемоглобина
Степень насыщения участков,
связывающих кислород (Y),

пока-
зана как функция парциального
давления О2 (рО2) в растворе.
Р50 – характеризует сродство к
О2 - это парциальное давление,
при котором насыщены 50%
участков связывания (Y=0,5).
Кривая зависимости имеет типич-
ную сигмоидную форму.
Впервые этот феномен в 1904 г.
описал Кристиан Бор [ Bohr C. (1904)
 Zentralblatt Physiol., 23, 688–690 ].
.
Слайд 8

1 3 2 2 4 1 4 3 Кооперативность в процессе

1

3

2

2

4

1

4

3

Кооперативность в процессе связывания кислорода с гемоглобином

4

1

2

3

1

2

2

4

3

1

3

4

Каждая молекула О2 связывается

с субъединицами гемо-
глобина в последовательности: 1(α1)?2(α2)?3(β1)?4(β2).
В результате этого меняется конформация следующей
субъединицы, что приводит к увеличению сродства центра
cвязывания в этой субъединице к молекуле О2. В целом
происходит нелинейное нарастание сродства всей моле-
кулы гемоглобина к О2.

О2

О2

О2

О2

Слайд 9

Типичная сигмовидная (S-образная) кривая зависимости скорости реакции аллостерического фермента от концентрации

Типичная сигмовидная (S-образная) кривая зависимости скорости реакции аллостерического фермента от концентрации

субстрата

Зона максимального
проявления
кооперативности

По мере линейного увеличения [S], проявление
эффекта (нарастание V реакции) происходит
НЕЛИНЕЙНО – т.е результат всегда больше, чем
простая сумма слагаемых явлений. Причина –
нелинейное увеличение сродства активных
центров аллостерического фермента к субстрату.

На этом участке коперативность
уже не проявляется

Слайд 10

Аллостерические ферменты Гомотропные ферменты Их аллостерический центр связывает молекулу S. При

Аллостерические ферменты

Гомотропные
ферменты
Их аллостерический
центр связывает
молекулу S.
При этом S не подвер-
гается каталитическому
превращению,

он
действует как
регулятор.

Гетеротропные
ферменты
Аллостерические
регуляторы не являют-
ся субстратами
фермента.

Слайд 11

В молекуле аллостерического фермента, активный центр пространственно отделен от центров связывания

В молекуле аллостерического фермента, активный центр пространственно отделен от центров связывания

аллостерических регуляторов.

Аллостерические
регуляторы

Положительные
регуляторы – увеличивают
aктивность: при одной и
той же [S], Km и/или Vmax
Отрицательные
регуляторы – снижают
активность: при одной и
той же [S], Кm и/или Vmax

Слайд 12

Аллостерические регуляторы, связавшись со своими центрами, вызывают конформационные перестройки всей молекулы

Аллостерические регуляторы, связавшись со
своими центрами, вызывают конформационные
перестройки всей молекулы фермента,

в первую очередь – каталитического центра.
В результате этого меняется сродство субстрата к ферменту ( Кm) или меняется
( Vmax). Возможно и то, и другое одновременно.

Общий механизм действия аллостерических регуляторов

Слайд 13

Схема механизма влияния аллостерического ингибитора (АЕ) на активный центр аллостерического фермента (AS) субстрат аллостерический ингибитор

Схема механизма влияния аллостерического ингибитора (АЕ) на активный центр аллостерического фермента

(AS)

субстрат

аллостерический
ингибитор

Слайд 14

В случае аллостерического фермента, незначительные сдвиги [S] приводят к существенным изменениям

В случае аллостерического фермента, незначительные сдвиги [S] приводят к существенным изменениям

скорости ферментативной реакции – основное проявления кооперативности во взаи-модействии активных центров.
Под влиянием незначительных концен-траций аллостерических регуляторов происходят значительные изменения каталитических свойств аллостеричес-ких ферментов: ΔKm и/или ΔVmax.
Слайд 15

У аллостерических ферментов, сигмо-видная форма кривой зависимости скорости реакции от концентрации

У аллостерических ферментов, сигмо-видная форма кривой зависимости скорости реакции от

концентрации субстрата – отра-жает явление кооперативного взаимодейст-вия каталитических центров в составе суб-ъединиц фермента.
+ кооперативность – регулятор повышает сродство фермента к субстрату, активирует фермент.
- кооперативность – регулятор снижает сродство фермента к субстрату, снижает активность фермента.
Слайд 16

Пример изменения сродства фермента к субстрату (Кm) без изменения Vmax под

Пример изменения сродства
фермента к субстрату (Кm) без
изменения Vmax под

влиянием
+ или - аллостерических
регуляторов.
Пример изменения Vmax без
изменения сродства фермен-
та к субстрату под влиянием
+ или - аллостерических
регуляторов.
Слайд 17

Характерные примеры регуляции активности аллостерических ферментов Активация протеинкиназы А (ПКА) с

Характерные примеры регуляции активности
аллостерических ферментов
Активация протеинкиназы А (ПКА) с

помощью цАМФ. Неактивная ПКА – тетрамер: 2 регуляторных и 2 каталитических субъединицы. цАМФ (аллостерический активатор) связывается со специфическими сайтами на регуляторных субъединицах ПКА, что приводит к диссоциации (особождению) каталитических субъеди-ниц. Они становятся активными и фосфорилируют соответстующие белки–мишени, изменяя их актив-ность.
Ретроингибирование или отрицательная обратная связь. Конечный продукт метаболического пути, явля-ясь аллостерическим ингибитором, снижает актив-ность регуляторных ферментов, расположенных в начале этого пути (АТФ подавляет активность фосфо-фруктокиназы и пируваткиназы гликолиза).
Слайд 18

В 1910-1913 гг. Арчибальд Хилл разработал матема-тический аппарат, позволяющий количественно оха-рактеризовать

В 1910-1913 гг. Арчибальд Хилл разработал матема-тический аппарат, позволяющий количественно

оха-рактеризовать степень проявления кооперативности [Hill A.V. (1910)  J. Physiol., 40]. 

А. Хилл рассматривал процесс в динамике: заполнение центров связывания молекулами лигандов происходит не мгновенно, а последовательно.
Для количественной характеристики этого явления в каждый данный момент времени им было введено понятие степень насыщения (Y):
y
Y =
1-y

Степень насыщения (Y) – отношение числа
центров, связавшихся с лигандом (у), к числу
центров, оставшихся свободными (1-у).
Y = 0, если все центры свободны; Y = 1, когда
все центры заняты.

Слайд 19

Уравнение Хилла k1 E + nS E(S)n k2 n – число

Уравнение Хилла

k1
E + nS E(S)n
k2
n – число

центров, связывающих S
k1 [E][S]n = k2 [E(S)n]
k1 [E][S]n
[E(S)n] =
k2
k1
= K , то: [E(S)n] = K [E][S]n
k2
Слайд 20

Для того, чтобы учесть процесс постепенного заполнения участков связывания молекулами субстрата,

Для того, чтобы учесть процесс постепенного заполнения участков связывания молекулами субстрата,

Хилл предложил эмпирическое уравнение:
K [S]n
Y = -
1+K[S]n
Если все участки связывания заняты молекулами S
(случай насыщения), то уравнение примет вид:
Y = K [S]n

для случая частичного
заполнения участков

Y – степень заполнения активных центров молекулами
субстрата

Слайд 21

y поскольку Y = 1-y y = K [S]n 1-y y

y
поскольку Y =
1-y
y
= K [S]n
1-y
y

lg = lg K + n х lg[S]
1-y
Логарифмирование уравнения позволяет линеаризовать график

Уравнение Хилла:

, то для случая насыщения:

Слайд 22

График Хилла lg [S] y lg 1-y наклон = n (tgα)

График Хилла

lg [S]

y
lg
1-y

наклон = n (tgα)

Чем больше величина n,
тем

больше кооперативность

α

n – численное представление
степени кооперативности

Слайд 23

График Хилла для кооперативного связывания (красная линия) и некооперативного связывания (зеленая

График Хилла для кооперативного связывания
(красная линия) и некооперативного связывания (зеленая

линия)

tgα1 > 1 – при кооперативном связывании;
tgα2 < 1 – при некооперативном связывании.

α1

α2

Слайд 24

Если рассматривать скорость ферментативной реакции, то уравнение Хилла будет иметь вид:

Если рассматривать скорость ферментативной реакции, то уравнение Хилла будет иметь вид:

v
lg = lg K + n х lg[S]
Vmax-v

v – скорость реакции при данной степени запол-
нения центров (определяется концентрацией
субстрата).
Vmax – максимальная скорость.

Слайд 25

Основы современных представлений о структуре и механизме функционирова-ния аллостерических ферментов были

Основы современных представлений о структуре и механизме функционирова-ния аллостерических ферментов были

заложены работами ряда исследовате-лей в период с 1955 по 1963 годы: Робертс, Амбуржье, Герхард, Парди, Моно, Жакоб, Шанжё.
Слайд 26

Модель согласованного механизма кооперативного взаимодействия S и E «Симметричная» модель или

Модель согласованного механизма кооперативного взаимодействия S и E

«Симметричная» модель или


модель Моно-Уаймена-Шанжё

Постулаты модели:
1. Фермент содержит 2 субъединицы: T или R
2. Т - напряженная конформация, низкое
сродство к S
R- релаксированная конформация,
высокое сродство к S
4. В отсутствии S: T ?? R (равновесие)
5. В присутствие S: T ? R (переход). Связы-
вание первой молекулы S – индукция пе-
рехода T ? R
6. Переход T ? R всегда согласован: 2T ? 2R
Аллост. ингибитор взаимодейств. с T и ста-
билизирует её.
Аллост. активатор взаимодейств. с R и ста-
билизирует её.

2T

2R

S