Генетика клеточного цикла. Протеолиз циклина под контролем АРС. (Глава 4)

Содержание

Слайд 2

Протеолиз циклина под контролем АРС. Два белка, активирующих АРС: Cdc 20

Протеолиз циклина под контролем АРС.
Два белка, активирующих АРС: Cdc 20

и Hct1
Активные формы Cdc 20 , Hct1, неактивная Cdc 20, Hct1

Anaphase Promotion Complex

Alberts et al., 2002

Слайд 3

Cdc20-APC и аналог Hct1-APC – деградация циклина. M-Cdk активирует Cdc20-APC M-Cdk

Cdc20-APC и аналог Hct1-APC – деградация циклина.
M-Cdk активирует Cdc20-APC
M-Cdk инактивирует

Hct1-APC фосфорилированием
Hct1-APC активируется в конце митоза, когда
снижается к-во M-Cdk и фосфатазы отщепляют фосфат
Sic1 – белок из группы CKI
M-Cdk инактивирует Sic1 фосфорилированием.
Sic1 активируется в конце митоза, когда
снижается к-во M-Cdk
В митозе снижается транскрипция М-циклина,
до этого работала положительная обратная связь

Поддержание инактивации M-Cdk после митоза
CycB

CKI

Слайд 4

Поддержание инактивации M-Cdk после митоза Уровень циклина снижается за счет активности

Поддержание инактивации M-Cdk после митоза

Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20-APC,

далее выпадение G1 и накопление циклина

Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20-APC, далее –активностью Hct1-APC, Sic1

Эмбриональные клетки без G1 фазы

Клетки с G1 фазой

Alberts et al., 2002

Слайд 5

Изучение перехода G1-S у S.cerevisia Мутации, связанные с арестом клеточного цикла,

Изучение перехода G1-S у S.cerevisia Мутации, связанные с арестом клеточного цикла,

получили в реакции на α-фактор

Норма: остановка в G0,
подготовка к конъюгации

Мутации сигнального пути:
нет ареста в G0,
нет подготовки к конъюгации

Мутации ареста клеточного цикла:
нет ареста в G0,
подготовка к конъюгации

Выделили мутации по генам Cln1, Cln2, Cln3

Слайд 6

Роль CLN3 в переходе Start CLN3- G1-циклин, уровень транскрипции постоянен Другие

Роль CLN3 в переходе Start

CLN3- G1-циклин, уровень транскрипции постоянен
Другие циклины CLN1,

2 –G1/S – транскрипция возрастает вблизи Start – петля положительной обратной связи

Искусственное увеличение количества Cln3 – деление при меньшем размере и наоборот.
Увеличение количества ДНК за счет минихромосом – задержка перехода к митозу. Размер клетки пропорционален плоидности
Стабильная форма Cln3:

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 7

Гипотетическая модель координации роста клетки и движения по клеточному циклу у

Гипотетическая модель координации роста клетки и движения по клеточному циклу у

дрожжей

Белки,
cвязывающие
Cln3

G1-циклин
Cln3

Cln3 синтезируется в G1 параллельно с ростом клетки.
Модель: количество Cln3 пропорционально количеству ДНК. Превышение порогового уровня циклина 3 запускает активацию G1/S-Cdk и продвижение к S- фазе

рост

рост

Свободный Cln3
cвязывается с Cdk
Активация S-фазы

Alberts et al., 2002

Слайд 8

Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia Уменьшение

Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia

Уменьшение количества

активной Cdk
(Cdc20-APC-обусловленный протеолиз циклина)
активирует через фосфатазы
Hct1-APC и белок Sic1. Инактивация M-Cdk белком Sic1,
убиквитин-зависимым протеолизом, снижением транскрипции

Cyc-Cdk:

Alberts et al., 2002

Слайд 9

Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia Аккумуляция

Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia

Аккумуляция G1-циклина

(Cln3):
на него не действуют ингибиторы.
G1-Cdk (Cln3-Cdk) запускает транскрипцию
G1/S-циклинов (Cln1,2). Активность G1/S-Cdk
инактивирует (фосфорилирует)
ингибиторы, инициирует транскрипцию
S-циклинов

Активная
форма
S-Cdk
запускает
S-фазу

Cyc-Cdk:

Слайд 10

Многоклеточные организмы. Флуктуации уровней циклинов в клеточном цикле. Экспрессия циклина D

Многоклеточные организмы. Флуктуации уровней циклинов в клеточном цикле. Экспрессия циклина D

(G1 -циклина) в ответ на митоз-стимулирующие агенты (митогены)

Циклины: D - G1 E – G1 /S переход A – S, G2 B – G2, M

Для клетки многоклеточного организма существует R – точка рестрикции – аналог точки Старт. В ней клетка выходит в G0 и ждет сигнала извне – ростового фактора – после чего перейдёт к репликации.

Слайд 11

Роль Rb белка в контроле перехода G1-S у многоклеточных Rb -белок

Роль Rb белка в контроле перехода G1-S у многоклеточных

Rb -белок ретинобластомы

инактивирует фактор транскрипции E2F
CycD-Cdk (G1-Cdk) инициируют фосфорилирование Rb в середине G1 и высвобождает фактор транскрипции E2F.
Фактор транскрипции E2Fактивирует транскрипцию генов, связанных с вступлением в S-фазу:
G1/S-циклина (Е)
S-циклина (А)
E2F
Cdk2
энзимов, необходимых для репликации
Слайд 12

Схема мутирования гена Rb и образования наследственной и ненаследственной форм ретинобластомы

Схема мутирования гена Rb и образования наследственной и ненаследственной форм ретинобластомы

у человека

Белок Rb – туморсупрессор, супрессор опухолей.
Мутации с потерей функции

Слайд 13

Инициация репликации ДНК у S.cerevisiae Основные участники ОRС-origin recognition complex (6

Инициация репликации ДНК
у S.cerevisiae

Основные участники
ОRС-origin recognition complex (6 белков: orc1-orc6)-прикреплен к

ori в течение всего цикла
Сdc6- регуляторный белок, прикрепляется к ОРС в начале G1 (фактор, вводящий геликазу)
Cdt1/Double-parked- нужен для введения геликазы
Mcm 2-7-белки – регуляторные близкородственные белки, часть пререпликативного комплекса pre-RC (гексамерная ДНК-геликаза)
S-Cdk циклин S-зависимая киназа

ORC
Сайт присоединения ORC

G1

G2-M

S

Cdt1, Cdc6
MCM
Pre-RC

S-Cdk
запускает
S фазу

Завершение
рекликации ДНК

Фосфорилирование
ORC

Alberts et al., 2002

Деградация фосфо-
рилированного Cdc6
Геминин инактивирует
Cdt1

Слайд 14

Компоненты организации репликации ORC комплекс из 6 белков Cdc7 CDK Cdc6-

Компоненты организации репликации

ORC комплекс из 6 белков Cdc7 CDK
Cdc6- нестабилен у

дрожжей(Т1/2=5 мин), появляется в G1
Cdt1
MCM (мутанты, не способные к репликации)
Geminin у многоклеточных разрушаются в метафазе под воздействием APC
Cyclin
Мутанты в системе протеолиза белков (лицензирующего фактора), накапливается избыточная ДНК (повторно реплицируется)
Слайд 15

Предотвращение повторной репликации S-Cdk: -запускает репликацию ДНК -фосфорилирует Сdc6, он отделяется

Предотвращение повторной репликации
S-Cdk:
-запускает репликацию ДНК
-фосфорилирует Сdc6, он отделяется от ОRС- предотвращение

репликации с этого ori. Фосфорилированный Сdc6 узнается комплексом SCF, убиквитинизируется.
-фосфорилирует Mcm-белки , это вызывает их экспорт из ядра – гарантия того, что комплекс Mcm больше не соберется
-фосфорилирует Cdt1
Geminin у многоклеточных накапливается в S, G2, M
Связывается - инактивирует Cdt1 и препятствует повторной сборке пререпликативного сомплекса -лицензированию репликации
RESET: в конце митоза активность всех Cdk падает до нуля.
Сdc6 и Mcm-белки и Cdt1 дефосфорилируются,.
Геминин и все циклины Е, А и В разрушаются с помощью APC.
pre-ORC может собираться снова
Слайд 16

Molecular Cell, Vol. 11, 997–1008, April, 2003, Copyright 2003 by Cell

Molecular Cell, Vol. 11, 997–1008, April, 2003, Copyright 2003 by Cell

Press
A p53-Dependent Checkpoint
Pathway Prevents Rereplication

Overexpression of Cdt1 and Cdc6
Shows the Appearance of Cells with Greater
than 4n DNA Content
(A–E) FACS analyses of H1299 cells infected
with adenoviruses expressing indicated proteins.
Left panels: histograms of cells stained
with propidium iodide for DNA content. y axis,
cell count; x axis, propidium iodide fluorescence.

Слайд 17

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009 Формы эндополиплоидии Эндоцикл Ререпликация Эндомитоз 64С

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009

Формы эндополиплоидии

Эндоцикл

Ререпликация

Эндомитоз

64С

Маркер митоза-
фосфо Н3
Достигают метафазы,
но нет цитокинеза

Слайд 18

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009 Примеры тканей, имеющих эндоцикл До 1000С Суспенсор- подвесок

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009

Примеры тканей, имеющих эндоцикл

До 1000С

Суспенсор- подвесок

Слайд 19

Фолликулярные клетки, окружающие ооцит: митозы, эндоциклы, амплификация. Полиплоидизируются (до 16 С),

Фолликулярные клетки, окружающие ооцит:
митозы,
эндоциклы,
амплификация.
Полиплоидизируются
(до 16 С), потом амплифицируют

гены белков хориона: в Х-хромосоме – в 15 раз, в 3-й хромосоме – в 60 раз.
Для амплификации требуется дрозофилиный гомолог белка ORC2

B.R.Calvi, M.A.Lilly & A.C.Spradling, 1998

до 16 С

до 2048 С

Слайд 20

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009 Регуляция эндоцикла у Drosophila Зеленым цветом

H.O.Lee, J.M.Davidson & R.J.Duronio, 2009

Регуляция эндоцикла у Drosophila

Зеленым цветом отмечены

активные компоненты, красным - репрессированные
Белки, активирующие АРС: fizzy (fzy/Cdc20) – в метафазе, fizzy-related (fzr/Cdh1) – в анафазе и далее в G1
Notch индуцирует транскрипцию fzr/Cdh1, репрессирует экспрессию string/cdc25, p21/p27-ингибитора S-Cdk
Drosophila Cki Dacapo инактивирует S-Cdk

Notch

Слайд 21

Эндорепликация Циркуляция CycE/Cdk2 и активного APC, циклинов А и В нет N.Zielke et al., 2008

Эндорепликация
Циркуляция CycE/Cdk2 и активного APC, циклинов А и В нет


N.Zielke et al., 2008

Слайд 22

S.Y.Park & M.Asano, 2008 Orc1 необходим для пролиферации. A,B,C- включение BdU

S.Y.Park & M.Asano, 2008

Orc1 необходим для пролиферации.
A,B,C- включение BdU в нервные

ганглии личинок,
wt- дикий тип
D,E,F – FRT-индуцированные клоны в глазо-антеннальном диске GFP/+
G,H,I - включение BdU в те же клоны
Слайд 23

+ GFP orc G1 G2 orc orc + + GFP +

+ GFP

orc

G1

G2

orc

orc +

+ GFP

+ GFP

G1

G1

Явление соматического

кроссинговера используют для тестирования мутаций

+ GFP

+ GFP

orc

orc

FLP-FRT система для искусственной митотической рекомбинации

hs-FLP ry+

FRT

Слайд 24

Orc1 необходим для амплификации (A-F) Two-cell orc1-/- somatic сlones of ovarian

Orc1 необходим для амплификации
(A-F) Two-cell orc1-/- somatic сlones of ovarian follicle

cells (stage11) generated in WT (A-C) and orc1+/- heterozygous (D-F) flies.
GFP (-/-)orGFP (+/+) clones are outlined.
DNA synthesis occurs only at the specifc amplifcation loci at this stage of oogenesis.
(G-J) Histochemical analyses of ORC1(G), ORC2(H), and DNA(I). A 3-cell/ somatic clone was generated in an orc1+/- heterozygote. Note that ORC2 also
fails to localize to the amplifcation loci in orc1-/- cells.

S.Y.Park & M.Asano, 2008

Слайд 25

S.Y.Park & M.Asano, 2008 Для эндорепликации не нужны белки orc1, 2,

S.Y.Park & M.Asano, 2008

Для эндорепликации не нужны белки orc1, 2, вероятно,

существуют другие, которые их заменяют в эндоциклах. У арабидопсиса два близких белка для митоза и эндорепликации orc1a и orc1b
Для пролиферации клеток и амплификации генов хориона белки orc1, 2 необходимы
Слайд 26

Слайд 27

Что вызывает активацию точек контроля ?

Что вызывает активацию точек контроля ?

Слайд 28

Какие структуры работают в точах контроля ?

Какие структуры работают в точах контроля ?

Слайд 29

Изучение точек контроля у дрожжей: Получение условных мутагенчувствительных мутаций Обработка слабой

Изучение точек контроля у дрожжей:
Получение условных мутагенчувствительных мутаций
Обработка слабой дозой радиации

(мутации rad)
веществами, блокирующими репликацию (гидроксимочевина) (мутации hus)
веществами, блокирующими сборку веретена деления (мутации mad - mitotic arrest deficient, мутации bub - budding uninhibited by benzimadazole)
Селекция мутантов с неправильной реакцией на обработку (не останавливали клеточный цикл)
Слайд 30

Обычная структура точки контроля Сенсор Передача сигнала Эффекторная часть Остановка клеточного

Обычная структура точки контроля

Сенсор

Передача сигнала

Эффекторная часть
Остановка клеточного цикла
Исправление повреждения
Апоптоз у многоклеточных

Слайд 31

Обработка колхицином, винбластином останавливает клетку в метафазе на часы. Хромосомы должны

Обработка колхицином, винбластином останавливает клетку в метафазе на часы.
Хромосомы должны быть

прикреплены к веретену: распознаются неприкрепленные кинетохоры и кинетохоры со слабым натяжением (прикреплены к одному полюсу)

К неприкрепленному кинетохору присоединяется
белок Mad2 - ингибируется Cdc20-APC и деструкция секурина
Mad2 - α-субъединица изопренил-трансферазы,

Точка контроля: переход М-А

Слайд 32

Точки контроля клеточного цикла. Переход М-А -дефект веретена -дефект полюсов (в

Точки контроля клеточного цикла. Переход М-А

-дефект веретена
-дефект полюсов (в т.ч. нереплицированная

центросома)
-дефект кинетохоров
К неприкрепленному кинетохору присоединяется
белок Mad2, ингибирует Cdc20-APC
Мутации:
mad- metaphase arrest deficient,
bub – budding uninhibited Benzimadazole
Кинетохорный белок Bub1 (киназа):
запускает сборку компонентов кинетохора (BubR1, CENP-F),
Контролирует правильное формирование кинетохора.
Слайд 33

Дефект микротрубочек Дефект Spindle pole bodies (аналогов центросом) Дефект кинетохоров М

Дефект
микротрубочек

Дефект Spindle pole
bodies (аналогов
центросом)

Дефект
кинетохоров

М

А

mad1-
mad2-

Структура точки контроля

M-A у S.cerevisiae
Слайд 34

Участие белков СРС- chromosomal passenger complex в точке контроля М-А Vagnarelli

Участие белков СРС- chromosomal passenger complex
в точке контроля М-А

Vagnarelli P.,

Earnshaw W., 2004

Mitotic centromere-associated kinesin (MCAK)

Слайд 35

СРС- chromosomal passenger complex INCENP в клетках He LA. Метафазы с

СРС- chromosomal passenger complex

INCENP в клетках He LA. Метафазы с нарушением

построения хромосом. Яркий сигнал на центромерах (стрелки)

Vagnarelli P., Earnshaw W., 2004

Слайд 36

Роль СРС в точке контроля веретена Дестабилизация и новое прикрепление кинетохора

Роль СРС в точке контроля веретена

Дестабилизация и новое прикрепление кинетохора

Сигнализация о

нарушении, остановка деления

Vader G. et al., 2007

Слайд 37

Слайд 38

Слайд 39

Слайд 40

Слайд 41

СРС- chromosomal passenger complex Survivin – член семейства IAP (Inhibitor of

СРС- chromosomal passenger complex

Survivin – член семейства IAP (Inhibitor of Apoptosis)


Присоединяет СРС к кинетохору, вовлечён в сегрегацию сестринских хроматид.
Участвует в точке контроля прикрепления хроматид к веретену - mitotic spindle assembly checkpoint (MSAC) , которая регулирует переход от метафазы к анафазе
После деления выходит из ядра и ингибирует апоптоз (имеет домен BIR - бакуловирусный IAP повтор). Одна из причин лекарственной устойчивости рака. Повышается в опухолевых клетках, особенно в устойчивых к терапии.
Borealin - регулятор клеточного цикла,
инактивируется в ответ на p53/Rb-сигналы,
активируется в раковых клетках
Кинетохорный белок Bub1 (киназа):
запускает сборку компонентов кинетохора (BubR1 CENP-F),
привлекает шугошин во внутренний кинетохорный район. В клетках с удаленным Bub1 СРС дестабилизирован и перемещен. Контролирует правильное формирование кинетохора.
Слайд 42

Точка контроля клеточного цикла. G1 G1 контроль повреждения ДНК. Поврежденная ДНК

Точка контроля клеточного цикла. G1

G1 контроль повреждения ДНК.
Поврежденная ДНК –

активация р53 – CKI
Блок активации G1/S-Cdk, S-Cdk

G1 контроль размера клетки перед Стартом
Сln3 у дрожжей

Повышенная стимуляция митогеном.
Активация р53 – CKI - апоптоз
Блок активации G1/S-Cdk, S-Cdk

Слайд 43

Точки контроля клеточного цикла у дрожжей. G2 G1-S G2-M или конец

Точки контроля клеточного цикла у дрожжей. G2

G1-S

G2-M или конец S. Контроль

завершения репликации.
Распознаются
-нереплицированные участки
-незавершенные вилки,
Сенсоры сигнализируют в систему контроля КЦ,
блок фосфатазы Cdc25 блокирует активацию M-Cdk.
Мутанты cdc2-3wD, cdc2-F15D, rad24 вступают в суицидальный митоз

G2 Контроль повреждения ДНК.
Поврежденная ДНК – киназы – инактивируют Cdc25
Блок активации M-Cdk
Мутации rad1, rad3, rad24, rad9 (регулятор репликации),
rad17(экзонуклеаза), hus1, hus2

Передача сигнала- протеинкиназы : Mec3, Rad53

G2 Контроль репликации центросомы.

Слайд 44

Структура точки контроля G2-M Murray A., Hunt T., 1993

Структура точки контроля G2-M

Murray A., Hunt T., 1993

Слайд 45

Болезнь «атаксия телангиэктазия»- синдром Луи-Бара – дефект одной из протеинкиназ, фосфорилирующих

Болезнь «атаксия телангиэктазия»- синдром Луи-Бара – дефект одной из протеинкиназ, фосфорилирующих

р53 в ответ на облучение - ATМ-киназа (ATM – ataxia telangiectasia mutated) (ответ на двунитевые разрывы)
ATR – ATM and Rad3 related – ответ на многие формы повреждения ДНК (генотоксический стресс )
киназы фосфатидилинозитол 3-подобные.
Центральные компоненты ответа на повреждения ДНК
Белок RPA взаимодействует с однонитевыми разрывами ДНК (остановленные вилки репликации, двунитевые разрывы ДНК, сайты репарации эксцизионные, мисматч)
привлекает ATR-киназу и белок ATRIP (ATR-interacting protein)
Rad17- подобен репликативному фактору С
Rad9 – кольцевой белковый комплекс, подобный PCNA
ATM и ATR активируют серин-треонин-киназы точки контроля Chk1 и Chk2
Chk1 и Chk2 ингибируют фосфорилированием Cdc25 фосфатазу, предотвращая вступление в митоз, фосфорилируют р53.

Точки контроля клеточного цикла:
Повреждения ДНК

Слайд 46

Cенсоры поврежденной ДНК L.Zou, D.Liu and S.J.Elledge, 2003 Rad9=*PCNA Rad17-RFC Двунитевые разрывы Однонитевые разрывы

Cенсоры поврежденной ДНК

L.Zou, D.Liu and S.J.Elledge, 2003

Rad9=*PCNA

Rad17-RFC

Двунитевые
разрывы

Однонитевые
разрывы

Слайд 47

Mdm2 Mdm2 p53 p53 p53 P P ДНК γ-лучи Деградация в

Mdm2

Mdm2

p53

p53

p53

P

P

ДНК γ-лучи

Деградация в протеосоме

Стабильный активный р53

ATМ/ATR-киназы
Chk1/Ch2-киназы

Ген р21

Транскрипция, трансляция

G1/S-Cdk
S-Cdk

G1- арест в

ответ
на повреждения ДНК

Убиквитин лигаза

GADD45

Слайд 48

RPA – ATR - амплификация сигнала ATRIP Передача сигнала: Активация Chk

RPA –
ATR - амплификация сигнала
ATRIP
Передача сигнала:
Активация Chk 1, 2

киназ
Эффекторная часть:
Фосфорилирование Cdc25 – остановка входа в митоз
Фосфорилирование р53 – транскрипция гена белка CKI – ингибитора комплекса cdk-cyclin

Сенсоры повреждения ДНК:

Слайд 49

Контроль декатенации – проверка отсутствия зацеплений ДНК в G2 перед входом

Контроль декатенации – проверка отсутствия зацеплений ДНК в G2 перед входом

в профазу митоза
Возможная модель сигнального пути
WRN- Вернер-геликаза (синдром Вернера), topo-II
Ингибиторы topo-II рассматриваются для использования при определенных формах рака
Слайд 50

Antephase checkpoint. Точка контроля в Антефазе отлична от контроля декатенации. Клетки

Antephase checkpoint.
Точка контроля в Антефазе отлична от контроля декатенации.
Клетки откладывают

вступление в профазу митоза (конденсацию хроматина) при обработке Х-лучами, микротрубочковыми ядами (колхицином), низкой температурой. Клетки, вступившие в профазу, деконденсируют свой хроматин (в нейробластах саранчи после облучения уменьшилось число клеток в профазе)
Короткий промежуток в конце G2
Ключевой белок – CHFR – неканоническая убиквитин-лигаза. Убиквитинизирует polo-like (Plk) киназу, тем самым воздействуя на Cdk-1, откладывая вхождение в митоз.
P38 – киназа играет роль в ответе на UV-облучение, осмотический стресс
Слайд 51

Antephase checkpoint

Antephase checkpoint

Слайд 52

Antephase checkpoint

Antephase checkpoint

Слайд 53

В точке контроля G1 р53 блокирует G1-Cdk через белок р21 В

В точке контроля G1 р53 блокирует G1-Cdk через белок р21
В точке

контроля G2/М р53 блокирует циклин В/Cdk через инактивацию фосфатазы Cdc25
Сенсоры стресса Growth Arrest DNA Damage (Gadd 45) у млекопитающих

Действие р53
в разные периоды цикла

Growth Arrest DNA Damage (Gadd) 45

Слайд 54

Белки GADD в ответе клетки на генотоксический стресс IR ионизирующая UV

Белки GADD в ответе клетки на генотоксический стресс

IR ионизирующая UV

(MMS)
радиация метилметан сульфонат
P53
GADD
Арест цикла Индукция апоптоза

cdc2 (связывается и ингибирует)
MEKK (связывается и активирует JNK каскад )
PCNA (proliferating cell nuclear antigen) прикрепляет ДНК-полимеразу δ к матрице (GADD связывается и модулирует работу ДНК-полимеразы )

GADD 45-α,ß,γ- очень кислые маленькие белки (18 kDa) с отрицательным зарядом -9 ... -12

TGFß- индуцированный апоптоз

Слайд 55

Контроль целостности ДНК G1 S G2

Контроль целостности ДНК

G1

S

G2