Полимеразды тізбекті реакция (ПТР)

немесе миллиард) көшірме жасалатын кең таралған зертханалық әдіс. ПТР-ның мақсаты - мақсатты ДНҚ аймағын қажетті мөлшерін алып, оны талдауға немесе басқа тәсілмен қолдануға болады.
1983 жылы К. Б. Муллис полимеразды тізбекті реакция (ПТР) әдісін ашқан, 1993 жылы Майкл Смитпен бірге химия бойынша Нобель сыйлығын алған.Бұл әдіс термоциклге негізделген.

Полимеразды тізбекті реакцияның үш сатылы процесі.
Britannica энциклопедиясы, Inc.

жүргізіледі:
ПТРерекшелігіпраймерлердің ДНҚ-ның қатаң анықталған бөлігін"тану"және молекулалық комплементарлық принципінесәйкес байланыстыруқабілетімен анықталады.
ПТР-дің негізгіқағидасы-полимерлеу реакциясы(мономерлінуклеотидтібайланыстарданДНҚ-ның полимерлітізбегінсинтездеу)көптеген қайталанатын циклдердің әрқайсысында белгілібірпраймерлерденбасталады.

ДНҚ фрагменттерін күшейту

Күшейту ДНҚ өнімдерін анықтау (элонгация)

ДНҚ-ны оқшаулау (денатурация)

келесікезеңін-ДНҚкүшейтудіжүзеге асыруүшін:
тек осымикробқа(инфекцияға)тәнДНҚмолекуласының кішкенебөлігі жеткілікті.

ПТР кезеңдеріне сипаттама

дәрігер пациенттен зерттеу үшін материал алып, оны арнайы өңдеуге жібереді.

өңдеу процесінде ДНҚ қос спиралы жеке жіптерге бөлінеді

Науқастың материалына реакцияның "тазалығына" кедергі келтіретін органикалық заттарды ерітетін арнайы сұйықтық қосылады

ДНҚ шаблондарын-ДНҚ — ның "клондалуы" болатын инфекциялардың ДНҚ молекулаларын қолданады.

ДНҚ күшейтілуінің негізі

ДНҚ-ның бір тізбегін екі есе көбейту арқылы жүзеге асырылатын ДНҚ — ның ДНҚ репликациясын аяқтаудың табиғи процесіне негізделген.

үшін бірминутқа тең қабылданады.
Элонгациятемпературасыполимеразаға байланысты.

Бұл кезең 7-10 минутқа созылады.

Элонгация.

Барлық циклдар аяқталғаннан кейін, барлық Бір тізбекті фрагменттерді аяқтау үшін көбінесе соңғы элонгацияның қосымша кезеңі жасалады.

үшінполимеразаұзақ уақыт бойыжоғары температурадабелсендіболуыкерек,сондықтан термофилдерденоқшауланған ферменттерқолданылады
Дезоксирибо[fr]нуклеозидтрифосфаттары(dATP,dGTP,dCTP,dTTP).
Полимеразажұмыс істеуіүшін қажетMg2+иондары.
Реакцияның қажетті жағдайларын қамтамасыз ететінбуферлікерітінді—рН,ерітіндінің иондық күші.
Реакциялық қоспаның булануынболдырмауүшін пробиркаға жоғары қайнағанмай,мысалы, вазелинқосылады.

Thermusaquaticus(Taq-полимераза),

Pyrococcusfuriosus[en] (Pfu-полимераза)

Pyrococcuswoesei(Pwo-полимераза)

Thermusthermophilus(Tth-полимераза)

полипиримидинді(Т, С)немесеполипуринді(A, G)созылған учаскелер;

"балқу температурасы(Tm)және күйдіру температурасы;

праймердің қайталама құрылымы;

праймерлердіңгомо -және гетеродимеризациясы.

екеуідебірдейбалқу температурасынаиеболатындайетіпжасалуыкерек.ЕгерпраймерлерTm -гесәйкес келмесе,күшейтуазболадынемесемүлдем жұмыс істемеуімүмкін,өйткені жоғарыTmпраймерітөмен температурададұрыс жұмыс істемейді.
Біржұптың екіпраймеріарасындағы Тмайырмашылығы4-6градустанаспауыкерек.Егерекіпраймердің Тмайтарлықтай өзгерсе, ондаеңазТмбарпраймерді3'ұшынан(соңғы өнімнің мөлшерін сақтай отырып)немесе5'ұшынан(эквивалентті)ұзартуғаболады.соңғы өнімнің мөлшерін ұлғайту).
Праймерді"тазарту"температурасы.
Taпраймері-бұл праймердіматрицаменбудандастыратынтемпература.Ta 4-5оС(және кейбіравторлардың пікірінше, 1-2оС)TMпраймерінентөмен.

қысқа олигонуклеотидтер.Праймерлер амплификация үшін керек.Праймер матрицалық ДНҚ молекуласының белгілі-бір бөлігіне комплементарлық принцип бойынша жабысып,ары қарай ДНҚ полимераза ДНҚ бөлігін синтездейді.
Taq-полимераза – температураға төзімді фермент,негізінен комплементарлы принципте 3´-соңына жабысады да,тізбекті құрастыруға кіріседі. Фермент өз атауын Thermis aquaticus термофильді бактериялардан штаммпродуцент атауымен алды.
Дизоксинуклеотидүшфосфаттар қосындысы (dNTP): dATP, dGTP, dCTP, dTTP болуы керек. ДНҚ молекуласының екінші комплементарлы тізбегін Taq-полимераза ферменті арқылы синтездеуге қолданылатын «құрылыс материалы».

қажетті реакциялық орта. Mg2+ ионы ПТР-дағы ДНҚ-полимеразаға қажетті кофактор болып табылады. Реакциялық қоспаның көптеген компоненттері осы иондар, соның ішінде ДНҚ-матрица, праймерампликондар жәнеар дНТФ байланыстырады. ДНҚ матрицасы зерттеудің нысаны болып табылады,яғни биологиялық материалдың (қан,тін,бактериялық медениет және т.б.)оқшауланған ДНҚ үлгісі.Олар хромосомалар,нуклеотидтер,плазмидтер немесе тірі ағзалардың әртүрлі түрлерінің генетикалық материал қоспасы болуы мүмкін.

ДНҚ матрицасы зерттеудің нысаны болып табылады,яғни биологиялық материалдың (қан,тін,бактериялық медениет және т.б.)оқшауланған ДНҚ үлгісі.Олар хромосомалар,нуклеотидтер,плазмидтер немесе тірі ағзалардың әртүрлі түрлерінің генетикалық материал қоспасы болуы мүмкін.ДНҚ матрицасы арнайы әзірленген праймерлермен анықталатын бірегей дәйектілікті(генетикалық маркерлер) қамтиды.ПТР үшін әдетте ДНҚ матрицасының 10-нан 100 нг-қа дейін қолданылады.Сонымен ДНҚ-матрица-амплифицирлеу үшін қажетті ДНҚ үлескісі бар бөлігі.Зерттелетін үлгі-алдын ала биологиялық материалдан бөлініп алынған геномдық ДНҚ молекуласы.

фрагменттерінің басталу және аяқталу аймағына сәйкес келеді.Праймерлер алға және кері праймер болуы мүмкін.Бұл праймерлер ДНҚ фрагментін белгілі бір нүктелерде байланыстырады,онда ДНҚ полимеразасын сол жерде орналасқан арнайы праймермен байланыстырады және жаңа ДНҚ тізбегін синтездеуге кіріседі.
Праймерлерді таңдау ПТР процесінің маңызды аспектісі болып табылады.Праймердің ұзындығын таңдау маңызды.Идеал ұзыныдығы 18-25 нуклеотид болар еді.Егер ұзындық тым қысқа немесе тым ұзын болса,праймерлер ДНҚ тізбегіне байланбайды,оны дәл күшейту керек.Ұзындығы өте қысқа праймерлер ДНҚ тізбегінің әртүрлі орындарында спецификалық емес праймерді тазартуға әкеледі.

Праймерлердің үш негізгі түрі бар:
-Олиго dT праймеры
-Кездейсоқ жүйе.Әдетте,немесе гексамер немесе наномер пайдаланылады.
-Ген-спецификалық праймер,мРНҚ зерттеу үшін қолданылады.

аралығында болуы керек.Праймерді тазарту температурасы мен балқу температурасы ПТР кезінде өмірлік маңызды фактор болып табылады.Балқу температурасын дәл есептеу керек,ал грунтты тазарту температурасы балқу температурасынан 5◦С төмен болуы керек.Балқу температурасы 60 ◦С және 75◦С болуы керек.Тым жоғары немесе тым төмен температура ДНҚ полимераза белсенділігінің төмендеуіне әкеледі.

температурасын ПТР-да қолданылатын праймер жұбы, праймер концентрациясы және ДНҚ-полимеразаның реттілігі негізінде есептейді. Калькулятор сонымен қатар праймер ұзындығын, GC пайызын, молекулалық массаны және сөну коэффициентін есептейді.
Өзгертілген Allawi & SantaLucia термодинамикалық әдісі T m және Platinum SuperFi, Phusion және Phire ДНҚ полимеразаларымен реакциялардың күйдіру температурасын есептеу үшін қолданылады. Параметрлер праймерде нақтылықты жоғарылату және жоғары өнімділікті сақтау мақсатында реттелді.
Бұл калькуляторды пайдалану үшін ДНҚ-полимеразды таңдап, праймер тізбегін енгізіңіз немесе қойыңыз және соңғы праймер концентрациясын енгізіңіз. T m мәндері, күйдіру температурасы және басқа деректер автоматты түрде жасалады.
Қажет болса, матрица-праймер жұбының әр тіркесімі үшін идеалды күйдіру температурасын одан әрі оңтайландыру және эмпирикалық түрде анықтау үшін температура градиентін қолданыңыз. Күйдіру температурасының градиенті компьютердің жасыту температурасынан 6-10 ° C төмен температурада басталып, созылу температурасына дейін жоғарылауы керек (екі сатылы ПТР).

күдікті мутацияларын анықтауға қолданылған. Ол оның бастапқы фрагменті ген-спецификалық праймерлердің көмегімен амплифицирленеді. Реакцияның соңғы нәтижесі зерттелетін материалдағы ДНҚ нысанасының бар екендігін көрсетеді. 

Кері транскрипциясы бар полимеразды тізбекті реакция. РНҚ құрамды вирустардың геномының арнайы учаскелерін анықтау немесе нысана-геннің транскрипциясын зерттеу үшін,

алдымен ревертаза ферментімен катализдейтін қайтымды транскрипция реакциясын пайдаланып, РНҚ-матрицадан ДНҚ-көшірмесін алады. Осылайша синтезделген қосымша ДНҚ-лар ПТР-де ген-спецификалық праймерлер үшін матрицалар болып табылады.

арқылы жүретін ПТР (RT-PCR) Кері транскрипция арқылы жүретін ПТР (RT-PCR) – геномы РНҚ молекуласынан тұратын организмдерді зерттеуде кеңінен қолданылады. Бірінші кезеңде аРНК молекуласын матрица ретінде қолдана отырып ревертаза (кері транскриптаза) ферменті арқылы біртізбекті ДНҚ молекуласын синтездейді.

Бұл синтезделген ДНҚ молекуласы келесі реттегі реакцияға қолданылады. Ол үшін екі вирустан бөлініп алынған кері транскриптаза ферменттерін қолданылады. Бұл ревертазаларды қолдану бірнеше қиындықтарды тудырады. Біріншіден олар жоғары температурада төзімсіз, яғни 42˚ жоғары температурада жоғары белсенділігі төмендейді.

жабысуына қажетті температураға дейін ДНҚ полимераза ферментінің белсенділігін бастай отырып жүргізілетін ПТР әдісінің жетілдірілген түрі.

уақыттық ПТР, qPCR, qRT-ПТР) - бір мезгілде берілген ДНҚ молекуласының мөлшерін өлшеу үшін полимеразды тізбекті реакция әдісіне негізделген зертханалық әдіс..

Бұл әдіс ПТР-дың жалпы принциптерінде қолданады. Негізгі айырмашылығы, амплификацияланғаннан кейін ДНҚ көлемі нақты уақытта өлшенеді. Сандық көрсеткішті анықтау үшін екі әдіс қолданылады: екі еселенген ДНҚ молекулаларымен араласқан флуоресцентті бояғыштар, гибридизациядан кейін ДНҚ-ның комплементарлы учаскілерімен флуоресценцияланатын модификацияланған олигонуклеотидтер.

көлемін өлшеу үшін, зерттеушіге жасушада осы мРНК мазмұны туралы сандық ақпаратты және ген экспрессиясы туралы ақпарат алуға мүмкіндік береді.

жүргізу алдында ДНҚ синтезі үшін кері транскрипция реакциясын жүргізу керек. Кері транскрипция реакциясы кері-транскриптазатпен ферментіменорындалады. Реакцияны праймерді қоспай, жүзеге асыруға болады, алайда, праймер қосылған кезде ең үлкен тиімділікке қол жеткізіледі. Праймерлердің үш негізгі түрі бар:

1
ОлигоdTпраймеры
2
Кездейсоқ жүйе. Әдетте, немесегексамернемесенонамерпайдаланылады.
3
Ген-спецификалық праймер, мРНК зерттеу үшін қолданылады.

аурулар қоздырғышын анықтауда қолданады.

ПТР-диагностика сонымен қатар әмбебап әдіс, себебі бөтен ДНК- ны әр түрлі биологиялық материалдардан – шырыш, зәр, қан, қақырық, эпителиалді жасушалар қырындысынан анықтауға мүмкіндік береді. ПТР диагностика жыныстық жолмен таралатын аурулар, әсіресе, жасырын немесе созылмалы –хламидиоз, уреплазмоз, гонорея, гарднереллез, микоплазматикалық инфекцияларды анықтауда кеңінен орын алған. Себебі, аталған аурулардың қоздырғыштарын зертхана жағдайында қарапайым жолмен өсіріп бөліп алу өте қиын және серологиялық реакцияларда антиденелер аз анықталады. Сондай-ақ, ПТР
диагностиканың көмегімен папиллома вирусын, вирусты гепатиттерді анықтауға болады.ПТР диагностика сонымен қатар генетикалық дактилоскопия, пренаталдық диагностика және т.б. жүргізуге зор мүмкіндік береді.